雙酶法酶解豬瘦肉蛋白工藝優(yōu)化研究

鄭培君 蔣愛(ài)民 邱 美 沈科能

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

雙酶法酶解豬瘦肉蛋白工藝優(yōu)化研究

鄭培君 蔣愛(ài)民 邱 美 沈科能

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

為制備臘味香精提供更豐富的前體物，以豬瘦肉為原料，水解度為指標(biāo)，選用Alcalase和Flavourzyme為試驗(yàn)用酶，通正交試驗(yàn)優(yōu)化雙酶法水解豬瘦肉蛋白最佳工藝條件。結(jié)果表明：Alcalase和Flavourzyme水解瘦肉蛋白其最佳條件為，pH 9時(shí)，用1 000U／g Alcalase于60℃下水解6h，再用2 500U／g Flavourzyme于50℃、pH 4.5繼續(xù)水解4h。此時(shí)，水解度達(dá)到34.82%，比Alcalase和Flavourzyme單酶水解度分別提高34.12%和27.48%，且酶解產(chǎn)物還含有豐富的制備臘味香精的前提物。

臘味；肉蛋白；雙酶法；酶解

肉香味是人類(lèi)飲食中最重要的香味之一，熱反應(yīng)是肉味香精形成的最主要的途徑之一［1］。豬瘦肉具有全面豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物，特別是含有能顯示出各種肉香味特征的類(lèi)脂類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)蛋白酶酶解瘦肉肉蛋白可以獲得很多肉味前體物質(zhì)，如游離氨基酸、胺、多肽等［2］，這些氨基化合物與羰基化合物可進(jìn)行羰氨反應(yīng)（Maillard熱反應(yīng)，后簡(jiǎn)稱(chēng)熱反應(yīng)），產(chǎn)生醛、酮、酯類(lèi)等具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)［3］，故以豬瘦肉酶解蛋白液進(jìn)行熱反應(yīng)得到的肉味香精更具逼真和強(qiáng)烈的肉味香氣及優(yōu)良的產(chǎn)品性能。

蛋白酶水解氮源物質(zhì)，再經(jīng)美拉德反應(yīng)制備肉味香精是肉味香精的主流技術(shù)。陳祖杰等［4］等利用蛋白酶解鰱魚(yú)肉生產(chǎn)復(fù)合調(diào)味料。譚斌等［5］以牛肉為底物，通過(guò)商品化蛋白酶制備牛肉水解物作為Maillard的反應(yīng)物，并對(duì)酶解產(chǎn)物對(duì)美拉德反應(yīng)風(fēng)味形成的影響進(jìn)行了探討。陳能飛等［6］研究了酶法水解豬血紅蛋白制備肉味香精的工藝。徐德峰等［7］選用復(fù)合蛋白酶對(duì)雞骨架蛋白進(jìn)行酶解，運(yùn)用響應(yīng)曲面法對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，酶解液可作為美拉德反應(yīng)制備肉味香精的優(yōu)質(zhì)底物。傳統(tǒng)的中式臘味肉制品獨(dú)特腌臘風(fēng)味的主要成分多為脂肪的水解氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。本試驗(yàn)采用雙酶法優(yōu)化蛋白水解工藝，使得蛋白水解液成為適合熱反應(yīng)制備臘味香精的優(yōu)質(zhì)前提物。

但是，酶法水解的動(dòng)物蛋白有一定的苦味。苦味肽的端基多為疏水性氨基酸，若用外切酶切除此類(lèi)疏水性氨基酸，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低得多［8］。風(fēng)味蛋白酶既是內(nèi)切酶也是外切酶，因此風(fēng)味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦，所以本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解，旨在改善水解效果的基礎(chǔ)上得到更優(yōu)質(zhì)的蛋白液。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉：冷藏，廣州市好當(dāng)家連鎖超市；

木瓜蛋白酶（800U／mg）、胰蛋白酶（3 500U／g）、堿性蛋白酶（200U／mg）：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

中性蛋白酶（1.5AU／g）、復(fù)合蛋白酶（1.5AU／g）、風(fēng)味蛋白酶（4×104U／g）：北京諾維信生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸等：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

高速分散均質(zhì)機(jī)：FJ－200，上海標(biāo)本模型廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4，常州澳華儀器有限公司；

精密pH計(jì)：PHS－3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；

離心機(jī)：Centrifuge 5804R，上海艾本德生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司；

全自動(dòng)凱氏定氮儀：Kjeltec 8200，瑞典Foss公司；

電子分析天平：BSA124S型，德國(guó)Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

瘦肉→清洗、解凍、絞碎→加水，預(yù)煮→調(diào)pH→加酶→酶解→滅酶，煮沸15min→4 000r／min離心20min→過(guò)濾，冷卻→瘦肉蛋白水解液

1.3.2 總氮量測(cè)定 凱氏定氮法，參照 GB／T 5009.5——2010。

1.3.3 游離氨基態(tài)氮的測(cè)定 甲醛電位滴定法，參照GB／T 5009.39——2003。

1.3.4 水解度的測(cè)定 水解度DH表示原料蛋白質(zhì)中肽鍵被裂解的百分?jǐn)?shù)，即蛋白質(zhì)被酶催化水解的程度［9］。水解度按式（1）計(jì)算：

式中：

DH—— 水解度，%；

N0—— 樣品總氮含量，%；

N1——酶解前游離氨基態(tài)氮含量，%；

N2——酶解后游離氨基態(tài)氮含量，%。

1.3.5 酶解條件單因素設(shè)定 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用同種試驗(yàn)原料，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同蛋白質(zhì)濃度、pH、溫度、時(shí)間和加酶量對(duì)蛋白酶水解效果的影響。

1.3.6 兩種酶水解條件的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)確定了 Alcalase（堿性蛋白酶）和Flavourzyme（風(fēng)味蛋白酶）在蛋白質(zhì)濃度、pH值、溫度、水解時(shí)間、加酶量對(duì)瘦肉蛋白水解度的影響的基礎(chǔ)上，為得到兩種酶水解瘦肉蛋白的最佳條件，選擇加酶量、pH、溫度、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)這兩種酶分別做4因素3水平正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的確定

試驗(yàn)測(cè)得瘦肉蛋白含量為21.81%。以瘦肉為底物，分別用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶，堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶，用去離子水調(diào)整蛋白濃度為9%、按表1各酶粗略水解條件進(jìn)行酶解。

表1 各酶粗略水解條件Table 1 The rough enzyme hydrolysis conditions

由圖1可知，水解效果較好的是風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶，堿性蛋白酶水解后水解液色澤呈透亮的淡黃色，澄清度較好，風(fēng)味蛋白酶水解后水解液澄清，有很好的肉香味，復(fù)合蛋白酶水解液體較渾濁，胰蛋白酶水解液有明顯異味，木瓜蛋白酶及中性蛋白酶水解度相對(duì)較低，這與袁永俊等的結(jié)果［10］不同，在水解魚(yú)肉蛋白酶解工藝采用胰蛋白酶及胃蛋白酶水解效果較好，這可能是由所采用的原料不同所致。綜合考慮上述結(jié)果，篩選出堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為水解酶。

圖1 不同蛋白酶對(duì)瘦肉酶解效果的影響Figure 1 Effect of protease on hydrolysis efficiency of Pork protein

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 蛋白濃度對(duì)水解度的影響 由圖2可知，風(fēng)味蛋白酶在蛋白質(zhì)濃度為6%時(shí)上升速率最高，9%之后趨于平緩。而堿性蛋白酶的趨勢(shì)變化不大。隨著豬瘦肉蛋白質(zhì)濃度增大，酶與底物的接觸機(jī)率增大，酶解開(kāi)始時(shí)水解度快速上升；隨著蛋白質(zhì)濃度的增大，整個(gè)反應(yīng)體系呈膠狀，流動(dòng)性減弱，導(dǎo)致酶與底物的作用機(jī)率減弱，在水解度達(dá)到最大之后開(kāi)始有平緩或降低趨勢(shì)［11］。考慮到節(jié)約能源，降低成本，所以堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶最佳蛋白質(zhì)濃度均為9%。

2.2.2 初始pH值的變化對(duì)水解度的影響 由圖3、圖4可知，pH對(duì)水解效果的影響較顯著。pH值影響酶的穩(wěn)定性，對(duì)水解反應(yīng)影響很大，故各種酶都有各自的最適pH值范圍。堿性蛋白酶在pH 8.5左右時(shí)，水解度最大，為21.76%，風(fēng)味蛋白酶在pH 5.0左右時(shí)，水解度最大，為27.09%，故堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶最適pH值分別取8.5和5.0。

圖2 蛋白質(zhì)濃度對(duì)水解度的影響Figure 2 Effect of protein concentration on hydrolysis degree

圖3 pH值對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解效果的影響Figure 3 Effect of pH value on Flavourzyme hydrolysis

圖4 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響Figure 4 Effect of pH value on Alcalase hydrolysis

2.2.3 溫度對(duì)水解度的影響 由圖5可知，溫度對(duì)水解效果的影響較明顯。在一定溫度范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度升高，水解度不斷增加，但超過(guò)一定溫度后，水解度會(huì)隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)升高溫度，反應(yīng)速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，但溫度過(guò)高，酶蛋白變性［12］，酶穩(wěn)定性下降，酶解效率隨之降低。所以，Alcalase和Flavourzyme的最適溫度均為55℃。

2.2.4 時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖6可知，隨著時(shí)間的增加，水解度不斷增加，當(dāng)增加到一定程度，增加的速度開(kāi)始變慢，這是由于隨著水解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)底物逐漸減少，酶解產(chǎn)物不斷積累對(duì)酶本身造成抑制［13］。綜合考慮效率與成本的問(wèn)題，單因素水解時(shí)間Alcalase為5h，F(xiàn)lavourzyme為3h。

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Figure 5 Effect of temperature on hydrolysis degree

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響Figure 6 Effect of reaction time on hydrolysis degree

2.2.5 酶添加量對(duì)水解度的影響 由圖7可知，隨著加酶量的增大，兩種酶的水解度都在增大，當(dāng)加酶量達(dá)到2 000U／g蛋白時(shí)，F(xiàn)lavourzyme的水解度達(dá)到28.46%，隨后其水解度變化不大，當(dāng)加酶量達(dá)到1 500U／g蛋白時(shí)，Alcalase的水解度達(dá)到25.87%，隨后其水解度增加緩慢。

圖7 加酶量對(duì)水解度的影響Figure 7 Effect of protease dosage on hydrolysis degree

2.3 兩種酶水解條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)確定了Alcalase和Flavourzyme在pH、溫度、時(shí)間、加酶量對(duì)瘦肉蛋白水解度的影響的基礎(chǔ)上，為得到兩種酶水解瘦肉蛋白的最佳條件，選擇pH、溫度、時(shí)間、加酶量因素對(duì)雙酶分別做4因素3水平正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2、表3，結(jié)果表見(jiàn)表4、表5。

表2 L9（34）Alcalase正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experimental design of Alcalase

表3 L9（34）Flavourzyme正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental design of Flavourzyme

表4 Alcalase正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 The results and analysis of orthogonal experiment

由表4、表5可知，pH對(duì)Alcalase水解度的影響最大，其次為溫度、時(shí)間和加酶量，最佳方案為A2B2C2D2，即加酶量為1 500U／g，pH為8.5，溫度為55℃，水解時(shí)間為5h。該條件下瘦肉蛋白的水解度為22.94%。同樣對(duì)Flavourzyme做正交試驗(yàn)，得出其最佳水解條件為加酶量2 000U／g、pH 5.0、溫度55℃、水解時(shí)間4h，該條件下水解度為26.25%。底物濃度均為9%。

表5 L9（34）Flavourzyme正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 5 The results and analysis of orthogonal experiment

2.4 雙酶組合對(duì)水解度的影響

根據(jù)表4、表5得出的最佳水解條件，向同樣底物濃度為9.0%的豬肉懸浮液中加入 Alcalase酶水解6h后高溫滅酶，然后調(diào)至Flavourzyme酶的最佳水解條件，加入Flavourzyme酶水解（或改變加入雙酶的水解順序），測(cè)定水解度，并與單一酶的水解度比較，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 水解酶加入方式的比較Figure 8 The Comparison of the hydrolas ezyme addition method

由圖8可知，雙酶法比單獨(dú)使用一種酶酶解的水解度明顯提高，比Alcalase和Flavourzyme單酶水解度分別提高34.12%和27.48%，所得產(chǎn)品水解徹底，為 Maillard反應(yīng)制備臘味香精提供優(yōu)質(zhì)的前體物。這與陳晶等的研究結(jié)果［14］較為相似。

3 結(jié)論

采用Alcalase酶和Flavourzyme酶雙酶分布水解瘦肉蛋白的最佳條件：蛋白濃度9.0%，pH 9.0時(shí)，加1 000U／g蛋白質(zhì)Alcalase酶于60℃水解6h；酶水解后高溫滅酶，再用2 500U／g蛋白Flavourzyme酶于pH為4.5、溫度為50℃下繼續(xù)水解4h。在此工藝下，瘦肉蛋白的水解度可達(dá)34.82%，比單獨(dú)用Alcalase酶和Flavourzyme酶水解水解度分別提高34.12%和27.48%，且此條件下得到的酶解液肉香濃郁，無(wú)苦味，多肽及氨基酸種類(lèi)多，有豐富的制備臘味香精的前體物可以用于臘味香精的研發(fā)。

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Study on the optimization hydrolysis condition of lean pork protein with twice enzymolysis method

ZHENG Pei－jun JIANG Ai－ming QIU Mei SHEN Ke－neng

（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China）

For the preparation of meat flavor to provide more abundant precursors，taking lean pork meat as raw material，degree of hydrolysis as an index，Alcalase and Flavourzyme were chosen as the two tool－enzymes.For the sake of getting the optimum conditions of two－enzyme hydrolysis，the orthogonal experiment was conducted.The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis was hydrolyzing protein with 1 000U／g Alcalase at pH 9.0，60℃for 6hours and then with 2 500U／g Flavourzyme at 50℃，pH 4.5for another 4hours，its hydrolysis degree could be reached 34.82%.Compared with those of hydrolyzing with Alcalase and Flavourzyme alone，hydrolysis degree were increased by 34.12%and 27.48%，respectively，and full of precursor of meat flavors for Millard reaction.

Cured and roasted meat；lean protein；twice enzymolysis method；enzymatic hydrolysis

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.060

廣東省重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2009A020101002）

鄭培君（1988－），女，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：peijun99＠yahoo.com.cn

蔣愛(ài)民

2011－08－01