以響應(yīng)面法優(yōu)化短小芽孢桿菌木聚糖酶產(chǎn)酶條件

葛慧華，林錦霞，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）

以響應(yīng)面法優(yōu)化短小芽孢桿菌木聚糖酶產(chǎn)酶條件

葛慧華，林錦霞，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021）

應(yīng)用響應(yīng)面分析對(duì)短小芽孢桿菌木聚糖酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到碳源、氮源及培養(yǎng)時(shí)間3種因素交互影響的回歸方程.從該方程得到理論最佳產(chǎn)酶條件：培養(yǎng)時(shí)間為24h，麩皮、玉米粉、蛋白胨和NH4Cl的質(zhì)量濃度分別為10，5，5，10g·L－1.在優(yōu)化條件下，實(shí)際最高產(chǎn)酶量為12.1mkat·L－1，與理論最高產(chǎn)酶量12.0mkat·L－1接近，比初始酶活提高12.2倍.

木聚糖酶；短小芽孢桿菌；響應(yīng)面分析；交互影響

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是木聚糖降解酶系中的關(guān)鍵酶，在造紙、食品、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等行業(yè)有廣泛應(yīng)用［1-2］.利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶，影響產(chǎn)量的因素除菌種本身以外，還和培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件密切相關(guān).如何快速、有效找出主效應(yīng)，確定最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件是關(guān)鍵.響應(yīng)面分析法是通過(guò)對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法 .應(yīng)用響應(yīng)面法得到的兩兩因素交互響應(yīng)面圖直觀地反映因素間的交互影響，便于實(shí)驗(yàn)者快速對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，提取有效信息［3］.已有報(bào)道利用該方法優(yōu)化木聚糖酶培養(yǎng)基并取得了較好的效果［4］，但缺乏對(duì)兩兩因素間交互影響的分析.本文在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取影響較大的碳源和氮源作為復(fù)合考察的兩個(gè)因素，以培養(yǎng)時(shí)間為第3個(gè)因素，經(jīng)響應(yīng)面分析法對(duì)短小芽孢桿菌木聚糖酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 菌種

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌液加15%已滅菌的甘油，于－70℃冰箱保存.

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成（g·L－1）：麩皮5.0，蛋白胨5.0，NaCl 1.0，K2HPO41.0，MgSO40.2，CaCl20.1.培養(yǎng)基滅菌之前用1mol·L－1NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.5.接種之前，保存在－70℃冰箱的菌體先在LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基活化約4個(gè)h，待光密度D（620）為0.46左右，以1%的接種量接種至不同組成的產(chǎn)酶培養(yǎng)基.在50mL搖瓶中裝液5mL，于37℃，250r·min－1按要求培養(yǎng).

1.3 木聚糖酶的提取和檢測(cè)

將培養(yǎng)液于4℃，15 000r·min－1下離心10min，取上清液，細(xì)胞沉淀用9g·L－1的NaCl洗2次，250g·L－1蔗糖液（加終濃度為1mmol·L－1EDTA）洗1次.粗酶液為第1次離心的上清液和3次洗液，稀釋一定倍數(shù)后使用.取0.2mL酶液（用一定pH值的緩沖液稀釋一定的倍數(shù)），加入到0.2mL用pH＝7.0，0.05mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（PBS）中配成的1%木聚糖溶液，于50℃下反應(yīng)10min，加入0.4mL的DNS試劑，煮沸5min；用水定容至2.4mL后，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值［5］，以木糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 .定義每秒鐘轉(zhuǎn)化1摩爾底物（被反應(yīng)物）所需的酶活力為1個(gè)酶活力單位（kat）.空白對(duì)照以0.2mL，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）代替粗酶液，其他的步驟同上.

1.4 復(fù)合因素考察產(chǎn)酶條件

為了優(yōu)化Bacillus pumilus木聚糖酶的最佳產(chǎn)酶條件，根據(jù)單因素單水平實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)碳源和氮源是Bacillus pumilus木聚糖酶生產(chǎn)的主要影響因素.由于該生產(chǎn)菌是芽孢桿菌類，培養(yǎng)時(shí)間不同，菌體的生長(zhǎng)水平相差較大，產(chǎn)酶水平也受限制.基于此，選取碳源（麩皮與玉米粉的質(zhì)量比）和氮源（蛋白胨與NH4Cl的質(zhì)量比）作為復(fù)合考察的兩個(gè)因素，培養(yǎng)時(shí)間（t）為第3個(gè)因素，安排3因素3水平實(shí)驗(yàn)，如表1所示 .統(tǒng)計(jì)分析用STATISTICA 軟件（30d試用版）［6］.

表1 3因素3水平設(shè)計(jì)表Tab.1 Factorial design of the 3factors and 3levels

2 結(jié)果與分析

2.1 初始培養(yǎng)條件的優(yōu)化

依據(jù)表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果如表2所示.表2中：z為木聚糖酶酶活力 .由表2可知，最高的木聚糖酶活力出現(xiàn)在第3組（z＝8.7mkat·L－1），比第11組（除培養(yǎng)時(shí)間外，其他培養(yǎng)條件相同）酶活力高出3.64倍.

表2 初始培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Optimal results of the primary culture condition

表3 實(shí)驗(yàn)系數(shù)的估計(jì)值Tab.3 Coefficient estimates by the regression model

應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行回歸分析，其t檢驗(yàn)值和P檢驗(yàn)值如表3所示.系數(shù)的可信程度與t檢驗(yàn)值成正比，與P檢驗(yàn)值成反比.即t檢驗(yàn)值越大及P檢驗(yàn)值越小，回歸系數(shù)的可信程度越高.當(dāng)試驗(yàn)在置信區(qū)間為99%和95%時(shí)，除X2，X21，X1X2，X2X3的系數(shù)外，其他系數(shù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.這些系數(shù)表明，其代表的因素可能為回歸模型的限制因子，改變這些因素值對(duì)木聚糖酶的生產(chǎn)有重要影響.

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸響應(yīng)分析，得到可以解釋各主因素對(duì)木聚糖酶生產(chǎn)的影響的二次模型為

式中：Y 為木聚糖酶的活力（mkat·L－1）；R＝0.979，P＜0.01.

整個(gè)模型的平方和（SS）結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)的R2值為95.78%，即只有4.22%的的變數(shù)不能由模型解釋.該模型的F檢驗(yàn)值為12.609，說(shuō)明模型可信度較高.

2.2 木聚糖酶生產(chǎn)影響因素的響應(yīng)面分析

應(yīng)用響應(yīng)面分析培養(yǎng)時(shí)間（X1）、麩皮與玉米粉的質(zhì)量比（X2）及蛋白胨與NH4Cl的質(zhì)量比（X3）對(duì)木聚糖酶生產(chǎn)的影響，3個(gè)因素兩兩相互作用的三維響應(yīng)面如圖1所示.

由表3可知，短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產(chǎn)與培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系（X1系數(shù)的P檢驗(yàn)值小于0.01），其他與木聚糖酶生產(chǎn)有關(guān)的因素有碳源的二次因子（X22的系數(shù)，P檢驗(yàn)值小于0.05）.如圖1（a）所示，當(dāng)麩皮與玉米粉的質(zhì)量比為5∶10或是10∶5時(shí)，木聚糖酶的產(chǎn)量都呈相似的上升趨勢(shì)，并且培養(yǎng)時(shí)間越短，酶產(chǎn)量越高.

一般而言，短小芽孢桿菌木聚糖酶的產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間需要16h左右，與其半對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)應(yīng).產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)20h后，芽孢快速生長(zhǎng)，使細(xì)胞裂解；當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始裂解時(shí)，蛋白激酶分泌到培養(yǎng)基中，使酶發(fā)生水解.本次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間為24h，比48h或72h的酶產(chǎn)量都要高，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間在短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產(chǎn)中起重要作用.

圖1 各因素與木聚糖酶產(chǎn)生的交互影響Fig.1 Interaction effect among the three factors responsible for xylanase production

由表3可知，蛋白胨與NH4Cl質(zhì)量比的一次效應(yīng)（P檢驗(yàn)值小于0.01）和二次效應(yīng)（P檢驗(yàn)值小于0.05）都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)重要意義.由圖1（b）可知，培養(yǎng)時(shí)間和蛋白胨與NH4Cl比例的交互影響，同樣對(duì)短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產(chǎn)有重要影響.培養(yǎng)時(shí)間越短，蛋白胨與NH4Cl比例越大，產(chǎn)酶量越高.

由圖1（c）可知，當(dāng)麩皮與玉米粉的質(zhì)量比及蛋白胨與NH4Cl的質(zhì)量比分別為5∶5和2∶5時(shí)，不考慮培養(yǎng)時(shí)間，木聚糖酶的產(chǎn)酶量最低.然而，當(dāng)培養(yǎng)基組成取值在圖中直徑最大的圓形區(qū)域以外的配比時(shí)，木聚糖酶產(chǎn)酶量最大.

2.3 與其他木聚糖酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化的比較

與其他細(xì)菌或真菌產(chǎn)木聚糖酶條件優(yōu)化比較，本優(yōu)化采用價(jià)格低廉的麩皮和玉米粉為復(fù)合碳源，未采用價(jià)格昂貴的木聚糖為單一碳源，約可使木聚糖酶整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的成本約降低25%［7］.優(yōu)化的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間僅為24h，與其他長(zhǎng)達(dá)11d的產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)比較，極大縮短了產(chǎn)酶時(shí)間.據(jù)報(bào)道［8］，利用響應(yīng)面法和中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化Aspergillus fischeri產(chǎn)木聚糖酶，培養(yǎng)72h后，產(chǎn)酶量?jī)H提高了1.9倍；而以纖維素大豆殘?jiān)鼮樘荚?，?yīng)用3因素2水平中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Bacillus circulans產(chǎn)木聚糖酶，培養(yǎng)120h后，產(chǎn)酶量提高了2.5倍［7］.另一以木聚糖為碳源的3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化Bacillus circulans D1產(chǎn)木聚糖酶，經(jīng)48h培養(yǎng)后，木聚糖酶產(chǎn)量也僅提高了3.15倍［9］.文獻(xiàn)［10］應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化嗜鹽細(xì)菌產(chǎn)胞外木聚糖酶，經(jīng)7d培養(yǎng)，產(chǎn)酶量提高了20多倍，但其使用價(jià)格昂貴的樺木木聚糖為底物，成本明顯高.

對(duì)于上述回歸出來(lái)的二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行求導(dǎo)求極值，在培養(yǎng)時(shí)間為24h，麩皮與玉米粉的質(zhì)量濃度分別為10，5g·L－1，蛋白胨與NH4Cl的質(zhì)量濃度分別為5，10g·L－1時(shí)，得到理論上最大木聚糖酶活力為12.0mkat·L－1.為了驗(yàn)證此培養(yǎng)基成份和培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，得到木聚糖酶活力平均值為12.1mkat·L－1，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)木聚糖酶的活力提高了12.2倍.

3 結(jié)束語(yǔ)

以價(jià)格低廉的麩皮和玉米粉為復(fù)合碳源，以蛋白胨和NH4Cl為復(fù)合氮源，對(duì)短小芽孢桿菌木聚糖酶產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，回歸出二次多項(xiàng)式回歸模型.對(duì)模型進(jìn)行分析，得到理論產(chǎn)酶極大值.將從模型導(dǎo)出的最高酶活力的培養(yǎng)基組成進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)值與理論值匹配良好，單位體積發(fā)酵液中木聚糖酶活力提高了12.2倍.

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Optimization of the Fermentation Conditions of Xylanase Production from Bacillus pumilus with Response Surface Analysis

GE Hui－h(huán)ua，LIN Jin－xia，ZHANG Guang－ya
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

The response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions of xylanase production from Bacillus pumilus.It resulted in a regression equation which reflected the interaction effect among carbon resource，nitrogen resource and cultivation time.The optimized fermentation conditions of xylanase production were：cultivation time 24 h，the proportion of bran and corn power 10∶5，the proportion of peptone and NH4Cl 5∶10.In this optimal conditions，the level of xylanase production was 12.1mkat·L－1，with an increase of 12.2－fold compared with the enzyme production in the basic medium.The experimental value was very close to the theoretic value，which was 12.0mkat·L－1according to the regression equation.

xylanase；Bacillus pumilus；response surface analysis；interaction

黃曉楠 英文審校：劉源崗）

TQ 925

A

1000－5013（2012）02－0172－04

2011－10－07

張光亞（1975－），男，副教授，主要從事酶與生物信息的研究.E－mail：zhgyghh＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2009J01030）；華僑大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（07HZR20）