云南蘿芙木異胡豆苷合成酶基因的克隆與分析

許若嫻，曹福祥，彭繼慶，司書(shū)斌

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

云南蘿芙木異胡豆苷合成酶基因的克隆與分析

許若嫻，曹福祥，彭繼慶，司書(shū)斌

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

以云南蘿芙木葉片為材料，通過(guò)RT-PCR方法首次克隆了云南蘿芙木萜類(lèi)吲哚生物堿（terpenoid indole alkaloids，TIAs）次生代謝的合成途徑中重要的限速酶——異胡豆苷合成酶（strictosidine synthase，STR）的基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)分析表明，該基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 038 bp，編碼345個(gè)氨基酸的多肽，等電點(diǎn)為5.06，N-端有一長(zhǎng)度為27個(gè)氨基酸參與分泌的信號(hào)肽。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)指出，延伸鏈和不規(guī)則盤(pán)繞是STR蛋白質(zhì)最大量的結(jié)構(gòu)元件，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)。同源性分析則表明，云南蘿芙木中的STR和其它植物來(lái)源的STR同源，使用MEGA5.1構(gòu)建了植物的STR分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

云南蘿芙木；萜類(lèi)引哚生物堿；異胡豆苷合成酶；RT-PCR；生物信息學(xué)分析

云南蘿芙木Rauvolfia yunnanensis Tsiang系夾竹桃科Apocynaceae蘿芙木Rauvolfia屬植物，主要分布于云南、廣西和貴州等地[1]。云南蘿芙木是一種重要的藥用植物，含有利血平(reserpine)、阿嗎堿(ajmalicine)、育亨賓(yohimbine)等多種萜類(lèi)吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids,TIAs）[2]，是治療高血壓、性功能障礙、癌癥等疾病的原料藥。TIAs生物合成的共同前體物質(zhì)是3α(S)-異胡豆苷，它是由色氨酸的衍生物色胺(tryptamine)以及萜類(lèi)衍生物裂環(huán)馬錢(qián)子苷（secologanin）在異胡豆苷合成酶(STR)催化下縮合生成[3]。在多種產(chǎn)TIAs的植物中，異胡豆苷是TIAs的普遍前體物質(zhì)，其它種屬特異性的酶和自發(fā)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)決定了之后生成的各種TIAs的最終形式。因此STR 是TIAs生物合成途徑中的最重要的關(guān)鍵酶，在TIAs代謝中具有至關(guān)重要的作用[4]。目前，STR基因已經(jīng)從長(zhǎng)春花、馬錢(qián)子、蛇根木草等植物中克隆，但還未見(jiàn)從云南蘿芙木中克隆該基因的報(bào)道，云南蘿芙木的研究主要集中在細(xì)胞工程和種植規(guī)范中[5]，本研究以蘿芙木葉片為材料，采用RT-PCR 克隆蘿芙木STR基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為實(shí)現(xiàn)蘿芙木TIAs代謝工程提供候選基因和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 云南蘿芙木中獲取STR

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的S T R的核苷酸序列以及Bam H Ι和S ac Ι酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：上游引物 fSTR5’-TATcggatccGGCCAAACTTTCTGATT CGC-3’，其中g(shù)ga tcc 是Bam H Ι位點(diǎn)。下游引物 rS T R P5’-CAAgagctcAACCAATCTGGTTCG TGGAA-3′，其中 gag ctc 是 S ac Ι 位點(diǎn)。

以云南蘿芙木葉片為材料，用RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)）提取總RNA，RT-PCR（Fermentas RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]，PCR反應(yīng)體系為：50 ng cDNA模板，50 mmol/L KCL,10 mmol/L Tris-HCL(pH8.3),1.5 mmol/L MgCl2,200 mmol/L dNTPs,1.25 U Taq DNA聚合酶和25×106 mmol的引物，加無(wú)菌雙蒸水至總體積為25 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃反應(yīng)2 min，共34個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目標(biāo)產(chǎn)物（回收試劑盒），純化后與PMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞[7]，挑選陽(yáng)性白色菌落單克隆測(cè)序并在LB+氨芐青霉素(ampicillin,Amp)100 mg/L 液體培養(yǎng)基中振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒[8]經(jīng)Bam H Ι/S ac Ι雙酶切、PCR 檢測(cè)驗(yàn)證及測(cè)序確認(rèn)序列。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 同源蛋白的搜索

根據(jù)測(cè)得的STR核苷酸序列，登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）使用ORF Finder，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，將其蛋白質(zhì)序列于NCBI中進(jìn)行Blastp搜索，選取部分植物的STR氨基酸序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 STR同源基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列分析

用DNAMAN對(duì)植物STR蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行多重對(duì)比分析，用MEGA5.1軟件，按Neighbor-Joining的方法，使用ClusterX分析得到的序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建來(lái)源于植物的STR分子系統(tǒng)樹(shù)。

1.2.3 STR的蛋白結(jié)構(gòu)分析

SOPMA(npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.HTML)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析[9]，使用Target P(www.cbs.dtu.dk/services/Target P/)和 Signal P(www.cds.dtu.dk/services/Signal P)進(jìn)行信號(hào)肽等結(jié)構(gòu)功能分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 STR的編碼序列的獲得與生物信息學(xué)分析

RT-PCR獲得了長(zhǎng)1 000 bp左右的特異性擴(kuò)增片段，產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后進(jìn)行了PCR鑒定，獲得1 058 bp，其中人工引入Bam H Ι的酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基（10 bp）和S ac Ι的酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基（共10 bp），獲得STR基因的編碼序列1 038 bp（圖1）。對(duì)STR基因的編碼區(qū)分析結(jié)果表明，該基因編碼345個(gè)氨基酸的多肽（圖1），等電點(diǎn)為5.06。

圖1 STR及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Strictosidine synthase gene of Rauvolfia yunnanensis and its deduced amino acid sequence

2.2 部分植物的STR蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)

選取不同種的植物STR蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖2）。結(jié)果表明STR序列在物種之間比較保守，在前30個(gè)左右的氨基酸中，發(fā)現(xiàn)高度保守的纈氨酸（V）、亮氨酸（L），都是帶有脂肪側(cè)鏈的疏水氨基酸。

用MEGA5.1軟件構(gòu)建來(lái)源于植物的STR分子系統(tǒng)樹(shù)（圖3），由圖可看出高等植物中STR分為兩種類(lèi)型，一種為來(lái)源于能產(chǎn)生TIAs的植物，包括云南蘿芙木，蛇根木和長(zhǎng)春花。另一種則來(lái)源于不能產(chǎn)生TIAs的植物，包括番茄，水稻，油菜。云南蘿芙木與長(zhǎng)春花都來(lái)源于夾竹桃科，圖上也看出它們組成了一個(gè)亞類(lèi)群。

2.3 STR的蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA對(duì)STR的二維結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到STR可能由21.16%的α-螺旋，34.20%的延伸鏈，15.65%的β-轉(zhuǎn)角和28.99%的不規(guī)則盤(pán)繞組成。由圖4可看出，延伸鏈和不規(guī)則盤(pán)繞是STR蛋白的最大量結(jié)構(gòu)元件，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖2 幾種植物的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequence of the STR from several plants

圖3 STR的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 A phylogenetic tree of the STR from various plants constructed by the neighbor-joining method on MEGA5.1

圖4 預(yù)測(cè)的STR二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The secondary structure of STR generated by SOMPA

對(duì)STR進(jìn)行了Target P分析后，得到結(jié)果表明此酶與分泌途徑有關(guān)，Signal P表明它有27個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽，在27和28之間是信號(hào)肽的裂解位點(diǎn)（cleavage site）。

3 討 論

本研究首次成功克隆了云南蘿芙木的STR基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析表明獲得的序列確實(shí)為云南蘿芙木中的STR，而且使用生物信息學(xué)分析了云南蘿芙木中STR的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。為以后繼續(xù)深入研究云南蘿芙木中萜類(lèi)吲哚生物堿代謝途徑的關(guān)鍵酶提供了基礎(chǔ)，為STR家族增添了新成員。分析發(fā)現(xiàn)一種STR來(lái)源于在能產(chǎn)生TIAs的植物中，另一種來(lái)源于不能產(chǎn)生TIAs的植物中。

關(guān)于TIAs的合成代謝途徑研究早在1950年就開(kāi)始展開(kāi)，1979年Treimer[11]等首次從長(zhǎng)春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中純化分離出了異胡豆苷合成酶（STR)，此后Anthony[12]等對(duì)此酶的性質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。1988年Kutchan[13]等首次對(duì)蛇根木中STR進(jìn)行cDNA克隆。Canel[14]等對(duì)長(zhǎng)春花中STR基因進(jìn)行操作，結(jié)果表明STR 基因的超量表達(dá)可以使生物堿水平提高。在其它不合成此類(lèi)生物堿的植物中超量表達(dá)編碼STR 的基因，也可以導(dǎo)致這些植物細(xì)胞合成此類(lèi)生物堿[12]。

克隆云南蘿芙木的STR基因揭示了影響云南蘿芙木中吲哚類(lèi)生物堿合成代謝的調(diào)控因子中分子層面的因素，為繼續(xù)深入研究提高TIAs生物堿合成代謝產(chǎn)物的累積提供了基礎(chǔ)。

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Cloning and analysis of strictosidine synthase in Rauvolfia yunnanensis

XU Ruo-xian, CAO Fu-xiang, PENG Ji-qing, SI Shu-bin
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ By using the leaf of Rauvolfia yunnanensis Tsiang as the material, utilizing RT-PCR, the strictosidine synthase gene,which was the key intermediate in terpenoid indole alkaloids (TIAs) was cloned and its bio-information was analyzed. The analysis results indicate that the DNA has been sequenced,revealing an open reading frame of 1038 base pairs, encoding 345 amino acids,an isoelectric point of 5.06, and 27 amino acids constructed a signal peptide that attend excrete at its N-end.The prediction of its secondary structure shows that extend strand and random coil was the most quantities in STR protein and α-spiral and β-outer corner distributed in the whole protein.The homology analysis manifests that STR in Rauvolfia yunnanensis Tsiang was homologous with STRs from other plant sources. MEGA5.1 was adopted to construct the phylogenetic tree of the STR.

∶ Rauvolfia yunnanensis Tsiang ;TIAs; STR; RT-PCT; bio-information

S718.46

A

1673-923X(2012)06-0128-04

2012-03-04

云南2007年度產(chǎn)業(yè)化重大關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目[云發(fā)改高科（2007）1718號(hào)]

許若嫻（1983—），女，湖南長(zhǎng)沙人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)

曹福祥（1962—），男，湖南新化人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物學(xué)和生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究；E-mail：csfucao@163.com

[本文編校：吳 彬]