紅錐優(yōu)良家系ISSR遺傳多樣性分析

楊 峰 ，李志輝 ，蔣 燚 ,2，楊模華

（1.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004；2.廣西林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530001）

紅錐優(yōu)良家系ISSR遺傳多樣性分析

楊 峰1，李志輝1，蔣 燚1,2，楊模華1

（1.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004；2.廣西林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530001）

利用ISSR分子標記技術，對來自廣西的32個紅錐Castanopsis hystrix家系進行遺傳多樣性分析。從廣西大青山實驗林場紅錐種質資源圃中選出32個優(yōu)良家系，通過每木檢尺等方法挑選出2～3株優(yōu)良單株進行樣品采集。從100對常用引物中篩選出的11個引物進行遺傳多樣性分析共擴增得到168個多態(tài)位點。結果得出：在大青山實驗林場采集的90個樣品總的多態(tài)位點率高達到100%，總的 Shannon信息指數(shù)（I）為0.550，Nei，s基因多樣性指數(shù)（h）為0.3697。這表明樣品的遺傳多樣性較高，個體差異大，聚類分析可以將32個家系分為三類。

優(yōu)良家系；分子標記；ISSR；紅錐；遺傳多樣性；聚類分析

紅錐Castanopsis hystrix Miq又叫刺栲，栲樹（浙江平陽），小紅栗栲，紅栲，紅錐栗，紅錐栲等，是殼斗科 Fagaceae栲屬Castanopsis (D. Don) Spach常綠喬木[1]，分布于福建南部、湖南南部、廣東、廣西、貴州西南部、西藏東南部墨脫等地區(qū)[2]。紅錐以其生長快速，適應廣泛，效益較高等特點深受人們的喜愛。果實富含淀粉、蛋白質、脂肪、B族維生素等多種營養(yǎng)素，可作食物、釀酒；樹皮、種子殼內含有單寧等物質，可制取栲膠；紅錐萌發(fā)力強，枝條生長迅速，枝繁葉茂，耐蔭蔽性較好，可混交也可純林種植，是松、杉混交造林較合理的伴生樹種之一[3]。但是由于土壤、氣候、溫度等一系列立地條件的不同和多樣性，紅錐廣泛的分布形成了不同種源間的差異，再加上長期的人為干擾，使得紅錐的遺傳變異變得十分豐富。想要提高紅錐單株立木的材積就必須選擇優(yōu)良品種進行栽培，傳統(tǒng)選育耗時耗力，所以選擇分子選育加快選育的進程，縮短選育的時間。近幾十年來，我國在大力提倡發(fā)展優(yōu)良珍貴鄉(xiāng)土闊葉樹種，而紅錐優(yōu)良特性的研究及開發(fā)應用得到了科研和生產(chǎn)部門的重視。營造紅錐人工林需要大量的健壯的苗木和優(yōu)質種子，為了能詳細地了解紅錐的進化過程、保護樹種基因的多樣性及制定合理的選育策略，對紅錐野生或人工林優(yōu)良植株的遺傳多樣性進行分析、分類、鑒定和良種選擇是很有必要的。

目前關于紅錐大多還是處于栽培、培育等方向上的研究，在DNA分子水平上研究的不是太多。因此本實驗采用ISSR方法進行研究。ISSR（inter simple sequence repeat），簡單重復序列區(qū)間分子標記技術[4]，是以重復序列的單一引物為主要引物序列的PCR標記，它利用包含重復序列并在3’或5’端錨定單寡聚核苷酸的引物對基因組DNA進行PCR擴增的標記系統(tǒng)[5-8]。它的引物比RADP的要長，退火溫度更高，因此具有更高的重復性和穩(wěn)定性[9-11]。比RFLP、SSR等多態(tài)性更高，已廣泛應用于品種選育和鑒定中了。

利用ISSR標記對5個不同種源的32個紅錐家系進行遺傳多樣性分析，主要是在合理利用與保護開發(fā)紅錐資源和選育優(yōu)良品種等方面提供理論依據(jù)，對探討其遺傳關系，構建紅錐指紋圖譜提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選用2002年4月種植于中國林科院熱林中心伏波分場的32個紅錐家系，家系分別來自于浦北、博白、憑祥、東蘭和容縣，采集了種源在浦北的8個家系，博白和容縣各采了7個家系，憑祥、東蘭各5個，每個家系采集2～3個樣，樣品數(shù)共90個，采樣時進行每木檢尺，記錄胸徑、樹高、冠幅等，再從家系測定的數(shù)據(jù)中，選擇綜合數(shù)據(jù)優(yōu)良植株進行采樣，采取葉片作為實驗對象。

1.2 實驗方法

采用改良CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨) 法[12]來提取DNA， DNA質量用0.7%瓊脂糖凝膠電泳來測，用紫外吸收法測定DNA的純度和濃度。將樣品稀釋至15 ng/μL，置于-24℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

篩選引物，從哥倫比亞大學公布的UBC800-UBC900的100條引物（由上海英駿生物技術公司合成）中選取11條擴增條帶較多、信號強、背景清晰的引物，對90個紅錐DNA樣品進行ISSR分析。

擴增反應運用美國的ABI公司生產(chǎn)的PCR擴增儀進行反應，總體積是20 μL的ISSR-PCR反應。 包 括 2.0 μL 10×buffer ，0.3 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物，1.4 μL 2 mmol/L Mg2+， 0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，30 ng的DNA模板。PCR最優(yōu)程序是：先將樣品進行94℃預變性5 min后，再開始PCR擴增循環(huán)，每個循環(huán)要進行94℃變性30 s，52 ℃～58 ℃變性45 s，72℃延伸2 min，要進行40個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后在72℃延伸7 min，最后4℃保存。對擴增產(chǎn)物用1.4%的瓊脂糖凝膠進行電泳，1×TBE的電泳液，用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

我們將電泳圖譜的每條DNA片段，都分別記做一個分子標記（marker），用以代表一個引物的結合位點。在根據(jù)各個分子標記的遷移率和有無，對擴增條帶進行賦值，將有擴增條帶的賦值為“1”，無擴增條帶的賦值為“0”，在Excel表格中形成“01”二元數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)實驗材料所統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，利用POPGEN32軟件進行分析。

2 結果分析

2.1 紅錐ISSR引物選擇和擴增結果

利用ISSR分子標記，以2個最優(yōu)單株和一個較差植株的DNA樣品為模板，從100條ISSR引物中篩選出11條較穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、重復性好的引物，對90個紅錐DNA樣品進行PCR擴增，擴增結果見圖1，共擴增出168條帶（從250 bp～2 300 bp）其引物編號和序列見表1。

圖1 引物808對紅錐群體進行ISSR-PCR擴增的電泳Fig.1 The electrophoresis of ISSR-PCR amplification for primer 808

2.2 紅錐種源家系聚類分析

生物個體的全部遺傳組成稱為基因型，而DNA就是基因型的決定者，它含有整套的遺傳信息，個體與個體之間的DNA是有差別的，這就導致個體之間表現(xiàn)型的千差萬別。環(huán)境和氣候對基因型的選擇也有一定的影響，這種作用是緩慢的持續(xù)的，必須經(jīng)過很長時間才能引起基因的改變。

從圖2系統(tǒng)樹中，可以看出在分為3支，即浦北和博白種源群體，容縣和憑祥種源群體及東蘭種源群。憑祥和容縣在地理位置上相距很遠，但是在紅錐的生長環(huán)境上卻極為相似，有一致的溫度和降雨量（溫度是21.8℃，年降雨量1 476.1 mm），相似的土質和氣候，這可能是兩者遺傳距離接近的原因，又因為參試憑祥種源是80年代在憑祥種植的人工林，原種子來源為玉林地區(qū)（含容縣、博白），可能也是兩者遺傳距離接近的原因之一。容縣、浦北和博白的地理位置相近，導致三者的遺傳距離較為接近。東蘭不管是氣候還是位置都與其他四個地方相差很大，所以遺傳距離最遠。

表1 紅錐ISSR引物編號及序列Table 1 UBC number of Castanopsis hytrix ISSR primer and their sequences

圖2 五大種源區(qū)聚類分析Fig.2 Cluster analysis on five seed source areas

根據(jù)對32個家系的聚類分析發(fā)現(xiàn)（圖3），各種源區(qū)均有小部分部分家系聚合在一起，這表明各家系間的遺傳距離較近，容縣家系聚合較緊密，表明該家系遺傳相似度很高，浦北和博白在地域性聚類不明顯，可能是由于兩地相距較近，基因交換較頻繁使得兩地遺傳距離較近，東蘭家系在圖3上的表現(xiàn)出與其他四個家系的遺傳距離較遠，進一步證實了環(huán)境的差異也是改變遺傳的一個重要原因，又依據(jù)其它種源收集的地理位置的不同，分析出地理環(huán)境的影響是普遍存在的，尤其在基因型方面。而基因型是適應環(huán)境的結果，是形成不同的家系或地理種源區(qū)主要原因之一，正由于基因的差異才讓我們區(qū)別不同種源區(qū)的個體成為可能，尤其是在使用分子分析方法上比比較表型分析更加準確。

圖3 32個家系聚類分析Fig.3 Cluster analysis on 32 superior genealogy

通過對群體數(shù)據(jù)遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)廣西紅錐的總多態(tài)位點數(shù)為168，總多態(tài)位點百分比（P）達到99.83%，總Shannon信息指數(shù)（I）為0.550，總的Nei's基因多樣性（h）為0.3697都顯示出廣西紅錐都具有極高的遺傳多樣性。

相較于王蕾等對紅錐10個不同種源的研究（多態(tài)位點百分比74.7%），多態(tài)位點百分比高出25.3%，也就是有效多態(tài)性條帶更多了。這就說明選擇優(yōu)良的家系對提高遺傳多樣性是有影響的。對群體多態(tài)性位點百分比的分析發(fā)現(xiàn)（表2），大青山實驗林場紅錐優(yōu)良家系的總群體基因多樣性（Ht）是0.3382，基因分化系數(shù)（Gst）為0.0546，群體內的變異達到了94.54%，說明紅錐的主要變異是存在于種群內部的。

表 2 不同群體遺傳多樣性分析Table 2 Genetic analysis of Castanopsis hystrix in different populations

3 討 論

采用ISSR分子標記對大青山實驗林場的紅錐進行遺傳多樣性的研究分析，歸納為以下幾點：

(1)通過PopGen32和PAUP4.0軟件對紅錐進行群體和個體分析，得出大青山實驗林場紅錐的遺傳多樣性程度豐富。從各個指標來看，多態(tài)位點百分率（100%），Shannon信息指數(shù)（0.550）和Nei’s基因多樣性（0.3697）等可表明這些樣品具有較高的遺傳多樣性水平。但是在各家系之間還是存在著差異，博白表現(xiàn)最好，它的多態(tài)性位點百分比是99.40%，說明其遺傳多樣性最豐富，對環(huán)境的適應力最強。

(2) ISSR分子標記技術的原理和操作與RAPD、SSR等相似，但與其相比ISSR不需要提前知道基因組序列，更減少了多態(tài)性分析的預備工作[14]。引物的長度一般在15～24 bp，退火溫度在52 ℃～58℃，遠高于RAPD的退火溫度，所以ISSR對PCR反應的敏感程度明顯低于RAPD；ISSR引物中含有一定長度的簡單重復序列，在復制過程中存在滑動和不均等交換，這使得在不同品種或群體及個體之間的重復次數(shù)存在很大差異，且更容易使引物結合位點和結合位點的片段長度產(chǎn)生差異[15]，而產(chǎn)物多態(tài)性遠比SSR、RFLP、RAPD豐富，可以提供更多的關于基因組的信息，而且實驗穩(wěn)定性高，重復性好，操作簡單、檢測結果方便，有著很好的發(fā)展前景。

(3)廣西地處中國的西南部，地理差別極大，地區(qū)的地形趨勢是由西北向東南傾斜，其中包含有盆地、溶巖、丘陵、臺地等地形相互交錯分布。氣候主要受季風環(huán)流和太陽輻射的影響。在地域上說，廣西是云貴高原向東南沿海的過渡地帶，使得廣西形成了復雜多變地貌類型。為紅錐基因型在地理上的分離和變異提供了有利條件。東蘭地處云貴高原南端，土壤屬亞熱帶闊葉林紅壤地帶，土壤母質是由鈣質頁巖、石灰?guī)r等構成，相較于憑祥等的地理地貌有較大的區(qū)別。憑祥在南寧西南方向，位于東經(jīng) 106°41′～ 106°59′；北緯21°57′～ 22°16′，地處中越交界，與越南涼山省毗鄰。土地肥沃，雨量充沛，平均日照達1 614 h，是典型的亞熱帶季風性氣候，浦北、博白、容縣與憑祥緯度相近，有類似的氣候，可能是造成遺傳距離相近原因。而東蘭由于土壤和氣候的差異，有較遠的遠的遺傳距離是很有可能的。

(4)群體的起源和生活型是決定群體遺傳變異和分化的主要因子，生存環(huán)境起到很大一部分作用。地理分布和立地條件的差異也是影響。因此，想要了解遺傳多樣性的影響因子就要對其大部分影響因子進行評價和分析，這樣才能正確評價遺傳多樣性。

4 結 論

紅錐優(yōu)良性狀的保持和遺傳多樣性的保護將是我們對紅錐研究的主要目的和任務。紅錐良種優(yōu)樹的選育和選擇，提高優(yōu)質樹木的產(chǎn)量，加快良種優(yōu)樹的培育進程，提高遺傳多樣性都是我們進一步研究的目標。依本研究所得數(shù)據(jù)來看，優(yōu)良家系的選擇已初見成效，但目前仍然存在著紅錐遺傳多樣性的損失，這不僅降低其群體對自然環(huán)境的適應，同時還會對經(jīng)濟和社會環(huán)境產(chǎn)生影響。有鑒于此，對紅錐的優(yōu)良家系選擇、評估紅錐遺傳多樣性水平是很有必要的。

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Genetic diversity of Castanopsis hystrix superior genealogy by ISSR marker

YANG Feng1, LI Zhi-hui1, JIANG Yi1,2, YANG Mo-hua1
(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2.Guangxi Forestry Science Research Institute, Nanning 530001, Guangxi, China)

∶ Genetic diversity of superior genealogy of Castanopsis hystrix from thirty two different ecological regions was analyzed by using the inter-simple sequence repeat（ISSR）. Select 32 superior genealogy from Daqingshan Test Forestry Farm in Guangxi province and we exploited log scaling choose 2～3 trees of excellent quality to collect sampling. We finded 11 effective primers were selected from 100 primers.We amplified 168 bands and them were polymorphic. The result showed asflollows：percentage of polymorphic bands were 100% which 90 samples were supplied by Daqingshan Test Foresty Farm，and the Shannon information index（I） was 0.550 and Nei，s gene diversity index （h）0.3697. These results indicated that Daqingshan Test Foresty Farm to supplied those samples of Castanopsis hystrix had high levels of genetic diversity and great individual variations.These thirty two superior genealogy were divided into three groups by cluster analysis.

∶ superior genealogy; molecular marker; ISSR; Castanopsis hystrix; genetic diversity; cluster analysis

S718.155

A

1673-923X(2012)07-0123-05

2012-04-25

國家“十一五”廣西林業(yè)科技項目“廣西主要優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種—紅錐良種選育與示范”（桂林科字[2009]2—1號），廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目“紅錐良種選育與豐產(chǎn)栽培模式研究”（桂科攻10100012—3）

楊 峰（1986—），男，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：林木定向培育

蔣 燚（1968—），男，廣西人，高級工程師，博士研究生，研究方向：森林培育

[本文編校：吳 彬]