農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化巨桉Eg5影響因素的研究

郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化巨桉Eg5影響因素的研究

郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

以巨桉無性系Eg5葉片為外植體材料，以GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，主要探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)基pH、共培養(yǎng)時(shí)間和乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果表明預(yù)培養(yǎng)3 d、菌液濃度OD600nm為0.5、接種30～60 min、共培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0、共培養(yǎng)基中添加150 mg·L-1AS、菌液中不添加AS、共培養(yǎng)1 d遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳，初步建立了巨桉Eg5的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

巨桉；農(nóng)桿菌；Eg5；遺傳轉(zhuǎn)化

Eg5是優(yōu)良的巨桉Euclyptus grandis W.Hill ex Maiden無性系，具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特點(diǎn)，在我國(guó)江西南部、湖南南部、福建中部等南亞熱帶地區(qū)已廣泛栽培，但巨桉Eg5也存在青枯病抗性較低、抗寒能力不足等問題。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可以將抗病、抗寒等目的基因轉(zhuǎn)入巨桉基因組中，將大大改善上述不良性狀。本文系統(tǒng)研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化巨桉Eg5的多個(gè)因素，旨在建立巨桉的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為巨桉的轉(zhuǎn)基因育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以生根培養(yǎng)45 d左右的Eg5無菌生根苗為試驗(yàn)材料，選取頂端完全展開的1～4片帶葉柄的葉片為外植體，剪去占全葉1/3長(zhǎng)度的葉尖部分。

1.2 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

農(nóng)桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，pH 7.0；預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良MS+TDZ0.12 mg·L-1+NAA0.25 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH 5.8；培養(yǎng)基在0.11 MPa壓力下，121℃滅菌17 min后冷卻待用。

1.3 農(nóng)桿菌菌株及質(zhì)粒

菌株為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的農(nóng)桿菌菌株GV3101含有載體質(zhì)粒pBI121，該質(zhì)粒攜帶有CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTⅡ基因和GUS基因。

1.4 農(nóng)桿菌工程菌液的制備

取-75℃凍存的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，在冰上解凍后劃平板活化培養(yǎng)3 d。挑取單菌落于4 ml液體LB培養(yǎng)基中180 rpm過夜培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm值達(dá)到0.2后，按照1∶40比例接入新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至所需OD600nm值，4 000 rpm離心8 min，再用等量的液體再生培養(yǎng)基重懸菌體備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本轉(zhuǎn)化條件

農(nóng)桿菌采用GV3101，將修剪好的葉片外植體于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d，菌液濃度OD600nm值0.5時(shí)侵染10 min，取出外植體于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。采用逐步優(yōu)化的方法進(jìn)行試驗(yàn)，每一步驟得到的結(jié)果將應(yīng)用到下一步的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中[1]。

1.3.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)設(shè)置為0、3、6、9、12、15 d 6種處理；菌液濃度試驗(yàn)設(shè)置OD600nm值0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 共 8 種 處理；接種時(shí)間試驗(yàn)設(shè)置為10、20、30、40、50、60 min 6 種處理；共培養(yǎng)基pH值試驗(yàn)設(shè)置為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2共7種處理；菌液中添加乙酰丁香酮試驗(yàn)設(shè)置為：0、45、90、135、180 mg·L-1共5種處理；共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮試驗(yàn)設(shè)置為：0、50、100、150、200 mg·L-1共5種處理。

1.3.3 試驗(yàn)重復(fù)

所有試驗(yàn)每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)外植體20～30個(gè)。

1.3.4 GUS染色分析

參照J(rèn)efferson R.A的GUS組織化學(xué)染色法[2]，共培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)葉片外植體進(jìn)行GUS染色。

1.3.5 轉(zhuǎn)化效果評(píng)價(jià)指標(biāo)

轉(zhuǎn)化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)為葉柄GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)。

GUS瞬時(shí)表達(dá)率是指葉柄有GUS藍(lán)斑的外植體占總外植體數(shù)的百分率，GUS瞬時(shí)表達(dá)率=

瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)指葉柄經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后整個(gè)葉柄被染色面積大小的程度，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)采用分級(jí)計(jì)數(shù)法，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)=

各字母代表數(shù)值見表1，分級(jí)計(jì)數(shù)法具體內(nèi)容可參見方中達(dá)植病研究方法一書[3]。

表1 巨桉Eg5葉柄侵染效果分級(jí)Table 1 Grading of infection effect on petiole of E.grandis clone Eg5

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有百分?jǐn)?shù)經(jīng)平方根反正弦化ASIN(SQRT(X))、個(gè)數(shù)經(jīng)平方根轉(zhuǎn)化SQRT(X)，采用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較（p=0.05）。文中數(shù)據(jù)為未轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要的影響因素，侵染前外植體一般要經(jīng)過一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)以促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂，使受體細(xì)胞處于更容易整合外源DNA的狀態(tài)，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[4]。表2的多重比較結(jié)果顯示，隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，預(yù)培養(yǎng)0 d和3 d，GUS瞬時(shí)表達(dá)率維持在40%左右，達(dá)到了最高水平；預(yù)培養(yǎng)3 d，葉片外植體進(jìn)入了最佳的脫分化時(shí)間，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)達(dá)到31%，染色效果最佳，顯著優(yōu)于其它水平；超過3 d后，葉片外植體則由脫分化狀態(tài)進(jìn)入了分化狀態(tài)，妨礙了外源基因的整合，所以對(duì)于Eg5葉片外植體來說最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

表2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 2 Effects of different pre-culture time on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.2 菌液光密度

光密度值是衡量農(nóng)桿菌菌液濃度的最好指標(biāo)[5]，通常以600 nm處菌液的可見光光度值OD600nm代表菌液的濃度進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)。由表3可知，隨著菌液光密度的逐漸增大，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。OD600nm為0.1時(shí)，由于細(xì)菌數(shù)量不足，葉柄部位GUS基因GUS瞬時(shí)表達(dá)率為0；OD600nm在0.2～0.4時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率維持12.22%～13.33%之間，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)維持在0.04和0.05之間；當(dāng)OD600nm達(dá)到0.5時(shí)，葉柄Gus瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)增加到了33.67%和0.11，達(dá)到了最大值，顯著優(yōu)于其它處理；OD600nm大于0.5時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)則逐漸下降。因此，適宜轉(zhuǎn)化材料的菌液光密度值OD600nm應(yīng)以0.5為最佳。

表3 菌液濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 3 Effects of different bacterial concentration on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.3 侵染時(shí)間

侵染時(shí)間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中非常重要的影響因素[6]，侵染時(shí)間10～20 min時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)維持在20%和0.1左右，未顯著提高染色效果；侵染時(shí)間達(dá)到30～60 min時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)與10～20 min相比獲得了明顯提升，此時(shí)間范圍兩指標(biāo)沒有明顯差異，但以侵染時(shí)間60 min的兩指標(biāo)為最高，葉柄GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到51.89%，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)達(dá)到0.25，所以農(nóng)桿菌GV3101的侵染時(shí)間為30～60 min為宜，且以60 min為最佳。筆者進(jìn)行抗生素抑菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葉片外植體經(jīng)過500 mg·L-1Cef處理后，置于100 mg·L-1Cef培養(yǎng)基中便可以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，侵染60 min不會(huì)造成后期農(nóng)桿菌的過度繁殖[7]。

表4 侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 4 Effects of different infection time on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.4 共培養(yǎng)pH

低于6.0的pH可以活化農(nóng)桿菌的Vir區(qū)，從而增強(qiáng)遺傳轉(zhuǎn)化效果，pH降至5.1～5.8將使Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)將達(dá)到最高水平[8]。表5顯示隨著pH的升高，葉柄GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。pH為5.2時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)最低，5.4～6.2各個(gè)水平間GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)無顯著差異，當(dāng)pH維持在5.8～6.0時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率和染色效果達(dá)到最高值，所以適宜GV3101轉(zhuǎn)化葉柄的共培養(yǎng)pH應(yīng)維持在5.8～6.0之間。

表5 共培養(yǎng)pH值對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 5 Effects of different Co-culture pH on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間

農(nóng)桿菌附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成，共培養(yǎng)時(shí)間是決定轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵[8]，國(guó)內(nèi)外研究也表明共培養(yǎng)時(shí)間是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要參數(shù)[9-10]。多重比較分析表明（表6），共培養(yǎng)時(shí)間1 d時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)均達(dá)到最大值，且與2、3、4、5 d存在顯著差異，而共培養(yǎng)2、3、4、5 d各處理間沒有顯著差異，所以最佳共培養(yǎng)時(shí)間為1 d。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，筆者也發(fā)現(xiàn)葉片外植體褐化率逐漸增大，所以較短的共培養(yǎng)時(shí)間既能減少農(nóng)桿菌的過度繁殖還可以提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。

表6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 6 Effect of Co-culture time on the agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.6 乙酰丁香酮的添加試驗(yàn)

乙酰丁香酮作為農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因活化的誘導(dǎo)物被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究工作中。許多研究表明不同的乙酰丁香酮添加方式對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高至關(guān)重要[11-13]。

2.6.1 菌液中添加乙酰丁香酮

本研究表明，菌液中添加乙酰丁香酮并未顯著提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)。表7的多重比較表明雖然GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨AS添加濃度的增大有逐漸增大的趨勢(shì)，但是各處理間的GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)的差異未達(dá)到顯著差異的水平；菌液中添加乙酰丁香酮并沒有顯著改善農(nóng)桿菌的侵染力，相反隨著GUS瞬時(shí)表達(dá)率的變大，葉柄瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)沒有明顯變化，卻使得葉柄的相對(duì)染色效果變差，對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化造成了不利影響。

表7 菌液中添加乙酰丁香酮對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 7 Effects of different AS concentration in bacterium liquid on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

2.6.2 共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮

與對(duì)照相比，共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮極大提高了葉柄的GUS瞬時(shí)表達(dá)率和瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)。表8顯示共培養(yǎng)基中添加50～200 mg·L-1的乙酰丁香酮與對(duì)照相比，顯著改善了葉柄GUS瞬時(shí)表達(dá)率，其中以添加100～200 mg·L-1的乙酰丁香酮使葉柄瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)達(dá)到最佳，添加150 mg·L-1的乙酰丁香酮時(shí)瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)達(dá)到最高。

表8 共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響?Table 8 Effects of different AS concentration in medium on agrobacterium mediated genetic transformation of E.grandis clone Eg5

3 結(jié)論與討論

本研究首次提出采用瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效果的一項(xiàng)指標(biāo)，目前，國(guó)內(nèi)外研究多采用瞬時(shí)表達(dá)率作為單一的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但瞬時(shí)表達(dá)率存在不能確切表示出葉柄染色程度的不足，瞬時(shí)表達(dá)率指數(shù)的提出很大程度上彌補(bǔ)了單一采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的不足，使轉(zhuǎn)化評(píng)價(jià)體系更為精確合理。目前有關(guān)巨桉遺傳轉(zhuǎn)化的研究在國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道，國(guó)際上也只有Yao J L等關(guān)于LBA4404介導(dǎo)巨桉的報(bào)道，其轉(zhuǎn)化研究?jī)H局限于莖段再生階段抗生素敏感性和菌液濃度兩方面[14]，本研究初步建立了農(nóng)桿菌GV310介導(dǎo)巨桉Eg5葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)影響巨桉Eg5遺傳轉(zhuǎn)化的因素預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)pH值、共培養(yǎng)時(shí)間和乙酰丁香酮等一系列因素進(jìn)行了全面報(bào)道。

3.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌侵染外植體前一般要經(jīng)過一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)使外植體細(xì)胞處于最佳的分裂狀態(tài)，以更好地接受外源基因的整合，許多研究也表明預(yù)培養(yǎng)對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的重要性[15-21]。桉屬植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究表明預(yù)培養(yǎng)時(shí)間大多維持在2～3 d[15-18,21]，本研究也表明巨桉Eg5葉片外植體的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d，楊樹屬植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間一般在0～1 d[19,22]，席夢(mèng)利等確定了杉木的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1～3 d[20]，柚木的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化研究表明最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為11～15 d[23]，由以上可知不同的樹種預(yù)培養(yǎng)時(shí)間存在一定的差異，可能是不同樹種在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)入最佳脫分化狀態(tài)的時(shí)間不同所致，所以預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定關(guān)鍵在于使外植體細(xì)胞處于最佳的脫分化狀態(tài)，否則，則會(huì)由脫分化狀態(tài)進(jìn)入分化狀態(tài)，從而妨礙外源基因的整合，對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化造成不利影響。

3.2 菌液光密度與侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

菌液光密度和侵染時(shí)間是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因素。本研究表明采用GV3101菌液OD600nm值0.5侵染巨桉Eg5葉片30～60 min瞬時(shí)染色效果最佳，這與桉樹屬植物多采用OD600nm值0.5以上的較濃菌液處理外植體10～30 min[14,17-18,21]的結(jié)果相一致，楊樹屬多采用OD600nm值0.2～0.4較稀菌液處理外植體10～20 min[19,22,24-25]，小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，采用OD600nm值1.0以上菌液侵染1 h以上，方能達(dá)到較好的轉(zhuǎn)化效果[26-28]。以上表明不同植物的最佳農(nóng)桿菌菌液OD600nm值及侵染時(shí)間不盡相同，相對(duì)楊屬樹種，這說明桉屬樹種對(duì)農(nóng)桿菌不太敏感，小麥由于是單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌最不敏感，桉屬樹種的轉(zhuǎn)化仍需要用相對(duì)較高的菌液濃度處理一定時(shí)間才能達(dá)到較好的效果。

3.3 添加乙酰丁香酮對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

本文中研究了菌液中添加乙酰丁香酮和培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮兩種添加方式對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響。很多研究表明菌液中添加乙酰丁香酮并不能顯著改善遺傳轉(zhuǎn)化效果，甚至?xí)档瓦z傳轉(zhuǎn)化率[19，29-31]，本研究也得出了同上述研究相一致的結(jié)論，對(duì)于沒能提高轉(zhuǎn)化率，分析可能有以下原因：一是乙酰丁香酮加入菌液時(shí)間不當(dāng)，有研究認(rèn)為在工程菌液使用前4～6 h加入，也有研究主張?jiān)谥苽浜霉こ叹汉蠹尤氩⒎胖靡欢〞r(shí)間之后再用于侵染，使農(nóng)桿菌既處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，又處于Vir基因高度活化狀態(tài)[8]。二是由于乙酰丁香酮需要加入有毒的二甲基亞砜溶解，二甲基亞砜的加入可能在一定程度上抑制了農(nóng)桿菌的侵染活力，使農(nóng)桿菌受到了毒害。三是加入的乙酰丁香酮濃度與工程菌液濃度之間存在一定協(xié)同效應(yīng)，菌液濃度過高，加入一定乙酰丁香酮?jiǎng)t不能使遺傳轉(zhuǎn)化率提高，菌液濃度得到稀釋后，加入乙酰丁香酮?jiǎng)t可顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化率[11]。

本研究表明共培養(yǎng)基中添加150 mg·L-1乙酰丁香酮?jiǎng)t大大提高了遺傳轉(zhuǎn)化率，許多研究也表明了共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的積極作用[11,12,32]。由于共培養(yǎng)階段是轉(zhuǎn)化的最關(guān)鍵階段，共培養(yǎng)時(shí)期添加乙酰丁香酮酚類物質(zhì)促進(jìn)了農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的表達(dá)和外源基因的整合，使遺傳轉(zhuǎn)化率獲得了大大提高。但也有研究認(rèn)為乙酰丁香酮與培養(yǎng)基pH值存在協(xié)調(diào)效應(yīng)，一定pH值條件下乙酰丁香酮才可以更好發(fā)揮其高效作用[12,33]。所以乙酰丁香酮與培養(yǎng)基pH值的交互作用還有待進(jìn)一步研究。

3.4 因素優(yōu)化順序

研究采用單因素逐步優(yōu)化法建立巨桉Eg5的轉(zhuǎn)化體系，一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在后期優(yōu)化結(jié)果低于前期優(yōu)化結(jié)果的問題，究其原因，可以從以下方面解釋：一是提供葉片外植體的幼苗生理狀態(tài)較差，某一批次的葉片外植體生長(zhǎng)時(shí)間過長(zhǎng)造成后期優(yōu)化結(jié)果較低。Tournier, V等[34]和Aggarwal, D等[35]曾報(bào)道幼嫩組織的遺傳轉(zhuǎn)化率和器官發(fā)生率均較高。二是活化的不同批次的農(nóng)桿菌之間可能存在侵染活力的差異。三是不同批次的GUS染色液其染色效果可能也存在一定差異。

[1] 范春節(jié). 尾赤桉再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系研究[D]. 北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院學(xué)位論文，2008.

[2] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.[J]. The EMBO journal, 1987,6(13):3901-3907.

[3] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 農(nóng)業(yè)出版社，1979.

[4] 唐克軒，張獻(xiàn)龍. 植物生物技術(shù)[M]. 科學(xué)出版社，2004.

[5] Sharma M, Kothari-Chajer A, Jagga-Chugh S, et al. Factors influencing Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of Eleusine coracana (L.) Gaertn[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2011,105(1): 93-104.

[6] 楊 波，丁莉萍，姚 璐，等. 苗齡和農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)小麥莖尖轉(zhuǎn)化效率的影響(英文)[J]. 分子植物育種，2008，6(2):358-362.

[7] 郭利軍，曾炳山，劉 英，等. 巨桉無性系Eg5的卡那霉素和頭孢霉素敏感性研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(3): 75-80.

[8] 王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程[M]. 科學(xué)出版社，2002.

[9] Dutt M, Grosser J. Evaluation of parameters affecting Agrobacterium-mediated transformation of citrus[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2009,98(3):331-340.

[10] 賴家業(yè)，石海明，劉 凱，等. 尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007, 44(2): 415-419.

[11] Huang F H, Li X Y. Effects of concentration of vacetosyringone and Agrobacterium tumefaciens on Gus gene transformation efficiency of Populus[J]. In Vitro Cell Dev Biol, 1994,30(3): 67.

[12] Godwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, et al. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species[J]. Plant Cell Reports, 1991,9(12):671-675.

[13] 陳 志, 陳金慧, 李婷婷, 等. 雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)雙價(jià)抗病基因影響因子研究[J]. 分子植物育種，2007,5(4):588-592.

[14] Yao J L, Lin-Wang K. Eucalyptus transformation method[Z].WO Patent WO/2005/032,241, 2005.

[15] Ho C K, Chang S H, Tsay J Y, et al. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Eucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants[J]. Plant Cell Reports,1998,17(9): 675-680.

[16] Prakash M, Gurumurthi K. Genetic transformation and regeneration of transgenic plants from precultured cotyledon and hypocotyl explants of Eucalyptus tereticornis Sm.using Agrobacterium tumefaciens[J]. In Vitro Cellular &Developmental Biology - Plant, 2009,45(4):429-434.

[17] Aggarwal D, Kumar A, Sudhakara Reddy M. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of selected elite clone(s) of Eucalyptus tereticornis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2011,33(5):1603-1611.

[18] Da Silva A L L, de Oliveira Y, Da Luz Costa J. Preliminary results for genetic transformation of shoot tip of Eucalyptus saligna Sm. via Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Biotechnology and Biodiversity, 2011,2(1):1-6.

[19] 諸葛強(qiáng), 王婕琛, 陳 英, 等. 新疆楊高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003,12(4):6-10.

[20] 席夢(mèng)利, 施季森. 不同因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杉木轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2007,43(3):46-50.

[21] Alcantara G B D, Bespalhok Filho J C, Quoirin M.Organogenesis and transient genetic transformation of the hybrid Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla [J]. Scientia Agricola, 2011,68:246-251.

[22] Confalonieri M, Balestrazzi A, Bisoffi S. Genetic transformation of Populus nigra by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports, 1994,13(5):256-261.

[23] 曾炳山, 裘珍飛, 李湘陽, 等. 柚木愈傷組織的LBA 4404轉(zhuǎn)化條件[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 28(3): 60-64.

[24] Liu T, Pang X, Long C, et al. Successful Agrobacteriummediated transformation of Populus tomentosa with apple SPDS gene[J]. Forestry Studies in China, 2008, 10(3): 153-157.

[25] 郝貴霞, 朱 禎, 朱之悌. 毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化的研究[J]. 植物學(xué)報(bào)，1999,41(9): 936-940.

[26] Cheng M, Fry J E, Pang S, et al. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Physiology,1997,115(3):971-980.

[27] 王永勤, 張愛民. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化幾個(gè)影響因素的研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2002,29(003):260-265.

[28] 張志清, 鄭有良, 王丕武, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幾個(gè)影響因素的再研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006, 24(1):1-6.

[29] 劉小琳, 王繼峰, 胡曉艷, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2007, 29(2):102-106.

[30] 鄭樹松, 安成才, 李啟任, 等. 乙酰丁香酮對(duì)棉花下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2003,15(2):125-126.

[31] 楊秀榮, 陳永文, 方 平, 等. 乙酰丁香酮對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002,27(5):751-754.

[32] 董喜才, 杜建中, 王安樂, 等. 乙酰丁香酮在植物轉(zhuǎn)基因研究中的作用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011, 32(5): 292-299.

[33] Holford P, Hernandez N, Newbury H J. Factors influencing the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Reports, 1992,11(4): 196-199.

[34] Tournier V, Grat S, Marque C, et al. An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree(Eucalyptus grandis× Eucalyptus urophylla)[J]. Transgenic Research, 2003,12(4): 403-411.

[35] Aggarwal D, Kumar A, Reddy M S. Shoot organogenesis in elite clones of Eucalyptus tereticornis[J]. Plant cell, tissue and organ culture, 2010,102(1): 45-52.

Study on the factors influencing Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Eucalyptus grandis clone Eg5

GUO Li-jun, ZENG Bing-shan, LIU Ying, LI Xiang-yang, QIU Zhen-fei
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

∶ By taking Eucalyptus grandis clone Eg5 leaves as explants, the GUS gene transient expression efficiency and transient expression efficiency index as evaluation indicators, effects of the pre-culture time, bacterial concentration, infection time, co-culture pH, co-culture time,Acetosyringone（AS）concentration in the bacterium liquid and Acetosyringone concentration in the medium on genetic transformation were investigated. The results show that pre-culture 3 days, 0.5 of OD600nm, 30～60 min of infection time, 5.8～6.0 of co-culture pH, 150 mg·L-1AS of the medium, and no AS in the bacterium liquid, 1day of co-culture time, the best transformation effects were achieved. Thus, an effective system for Agrobacterium-mediated transformation of Eucalyptus grandis clone Eg5 was established.

∶ Eucalyptus grandis; Agrobacterium tumefaciens; Eg5; genetic transformation

S792.39；Q943.2

A

1673-923X(2012)06-0061-06

2012-03-09

863高新技術(shù)項(xiàng)目“白樺、桉樹等分子育種與品種創(chuàng)制”項(xiàng)目編號(hào)(2011AA100202)

郭利軍(1983—)，男，河北蠡縣人，碩士研究生，主要從事熱帶林木組培快繁和桉樹轉(zhuǎn)基因研究

曾炳山(1969—)，男，江西井岡山人，博士，研究員，主要從事熱帶林木組培快繁和基因轉(zhuǎn)化研究

[本文編校：吳 彬]