五氯酚對(duì)稀有鮈鯽胚胎毒性效應(yīng)研究

熊 力,馬永鵬,毛思予,蘇永良,金幫明,劉 堰* (.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 40075；.重慶市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶市臨床檢驗(yàn)中心,重慶 40006)

五氯酚對(duì)稀有鮈鯽胚胎毒性效應(yīng)研究

熊 力1,馬永鵬2,毛思予1,蘇永良1,金幫明1,劉 堰1*(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715；2.重慶市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶市臨床檢驗(yàn)中心,重慶 400016)

研究五氯酚(PCP)對(duì)稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效應(yīng).以7.5,30,60,120,250μg/L5個(gè)濃度的PCP對(duì)0hpf(hpf,受精卵孵出時(shí)間)的稀有鮈鯽胚胎進(jìn)行暴露染毒,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、二甲基亞砜溶劑對(duì)照組和雌二醇(EE2,2.5ng/L)陽(yáng)性對(duì)照組.在立體顯微鏡下觀察整個(gè)胚胎的發(fā)育過程,統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率、96hpf相對(duì)存活率和各時(shí)期的畸形率,并利用半定量RT-PCR檢測(cè)胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達(dá).結(jié)果表明,PCP暴露能延遲稀有鮈鯽胚胎發(fā)育,并造成胚胎卵凝結(jié)、心包囊腫、脊柱彎曲等多種畸形甚至死亡.隨著PCP暴露濃度的升高,稀有鮈鯽胚胎的孵化率和96hpf相對(duì)存活率降低,各時(shí)期的畸形率增加,并呈現(xiàn)一定的濃度效應(yīng).稀有鮈鯽胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA表達(dá)被顯著誘導(dǎo),并隨PCP濃度的升高而增加.PCP對(duì)稀有鮈鯽胚胎發(fā)育表現(xiàn)為顯著的毒性效應(yīng).稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對(duì)存活率、各時(shí)期畸形率及CYP1A基因和p53基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)PCP毒性作用的敏感指標(biāo).

稀有鮈鯽；胚胎發(fā)育；五氯酚；毒性效應(yīng)；CYP1A；p53

五氯酚(PCP)及其鈉鹽作為一種高效廉價(jià)的殺蟲劑、木材防腐劑及除草劑,在世界范圍內(nèi)廣泛使用. PCP是氯酚類中最具毒性和最難降解的有機(jī)污染物,被美國(guó)EPA列為優(yōu)先檢測(cè)污染物和潛在致癌物,也是我國(guó)優(yōu)先監(jiān)測(cè)污染物之一[1-2].其曾在中國(guó)長(zhǎng)江中下游11個(gè)省、市、自治區(qū)被大范圍、長(zhǎng)時(shí)間地用于殺滅釘螺和控制血吸蟲病,最終進(jìn)入水體生態(tài)系統(tǒng)對(duì)水環(huán)境造成了持久污染[3-5].PCP性質(zhì)較穩(wěn)定,不易被氧化,易積累,具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變性[6-7].對(duì)于多種魚類,PCP都具有強(qiáng)毒性,其 96hLC50值在 32～205μg/L之間[8].PCP可導(dǎo)致稀有鮈鯽血細(xì)胞和肝細(xì)胞DNA明顯的斷裂和遷移,造成DNA損傷[9],具有顯著的遺傳毒性.

利用魚類胚胎發(fā)育技術(shù)測(cè)定化學(xué)品的毒性作用具有材料方便易得、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性及可靠性較高等優(yōu)點(diǎn),而且與傳統(tǒng)的魚類急性實(shí)驗(yàn)相比,成本低、影響因素少、靈敏度更高,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于化合物的致毒和致畸效應(yīng)研究[10].稀有鮈鯽作為中國(guó)特有的一種實(shí)驗(yàn)用魚,具有個(gè)體小,對(duì)溫度、溶解氧等環(huán)境條件適應(yīng)性強(qiáng),飼養(yǎng)方便,不易染病等優(yōu)點(diǎn),而且繁殖季節(jié)長(zhǎng),飼養(yǎng)條件下可以周年產(chǎn)卵,性成熟快,在水溫適宜和餌料充足條件下4個(gè)月左右即可達(dá)到性成熟并產(chǎn)卵[11].已有試驗(yàn)證實(shí),稀有鮈鯽對(duì)重金屬、農(nóng)藥等化學(xué)品非常敏感,是進(jìn)行化學(xué)品毒性測(cè)試和環(huán)境水樣毒性實(shí)驗(yàn)的理想材料[12].但目前利用稀有鮈鯽胚胎發(fā)育技術(shù)研究?jī)?nèi)分泌干擾物毒性效應(yīng)的工作還未見報(bào)道.因此,本研究以稀有鮈鯽的胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料,觀察 PCP暴露引起的胚胎發(fā)育變化,統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率、96hpf相對(duì)存活率、各時(shí)期的畸形率來(lái)評(píng)價(jià)PCP的發(fā)育毒性和致畸性,并選擇 CYP1A基因和抑癌基因 p53為生物標(biāo)志物,為從分子水平上進(jìn)一步探討五氯酚的胚胎毒性作用機(jī)制提供基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)生物

健康的稀有鮈鯽種魚購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所,在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖超過4年,每天早晚喂養(yǎng)鹽水孵化的豐年蟲(豐年蟲卵購(gòu)于天津丹陽(yáng)水產(chǎn)有限公司).實(shí)驗(yàn)用魚為性成熟的健康成魚體重:(0.53 ± 0.15)g, 體長(zhǎng):(36.6± 3.7)mm.按照雌雄比 1:2養(yǎng)在水族箱中,水溫: (26±1)℃、光照/黑暗周期=12h/12h,飼養(yǎng)2周后開始收集魚卵.飼養(yǎng)用水為連續(xù)曝氣24h的自來(lái)水,pH:7.6±1.5,溶解氧在 5mg/L以上,總硬度為7.8±0.7德國(guó)度.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

試劑:五氯酚(PCP,純度:99%)購(gòu)于 Chem. Service,雌二醇(EE2,純度:98%)購(gòu)于美國(guó)SIGMA,以二甲基亞砜(DMSO:購(gòu)于Sanland- Chem)為溶劑,配制成各需要的濃度(實(shí)際染毒溶液中DMSO的濃度不超過 0.01%,經(jīng)DMSO染毒稀有鮈鯽胚胎預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DMSO濃度不超過0.01%時(shí),稀有鮈鯽胚胎發(fā)育基本不受影響),Total RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent kit)購(gòu)于TaKara公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

所用主要儀器:玻璃水族箱,缸外過濾器, Nikon elicspe 80i生物顯微鏡,Nikon雙目立體顯微鏡,NUNC24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,光照恒溫培養(yǎng)箱,凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad),Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad),大龍可調(diào)式連續(xù)加樣移液器.

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

按照文獻(xiàn)[10,13]方法設(shè)置稀有鮈鯽胚胎染毒實(shí)驗(yàn),開始實(shí)驗(yàn)前配制7.5,30,60,120,250μg/L 5個(gè)濃度的PCP儲(chǔ)備溶液(濃度選擇依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室2次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果)和2.5ng/L一個(gè)濃度的EE2溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組,同時(shí)設(shè)置一個(gè)DMSO溶劑對(duì)照組和一個(gè)空白對(duì)照組.胚胎暴露染毒過程中的試驗(yàn)用水,均為超濾除菌并充分氧飽和、溫度保持(26±1)℃ 的本地自來(lái)水.

由于化合物作用時(shí)間不同,作用靶位點(diǎn)各不相同,所以選擇同一批受精卵產(chǎn)出后立即進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn),即 0hpf染毒.用立體顯微鏡挑選發(fā)育正常的稀有鮈鯽受精卵進(jìn)行實(shí)驗(yàn).選用 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為染毒器具,每孔容積為 3mL,實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加入2mL試液,放入2枚受精卵,每塊多孔板中,10孔為同一實(shí)驗(yàn)濃度,其余4個(gè)孔為空白對(duì)照,每個(gè)濃度在不同的板上做一個(gè)平行組.塑膠膜封面以免溶劑揮發(fā)改變實(shí)驗(yàn)濃度.將密封好的多孔板放在(26±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每12h換液一次.為保證實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性,先后進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).

1.4 顯微觀察

參照文獻(xiàn)[14]中斑馬魚可以觀察的毒理學(xué)終點(diǎn)、不同類型指標(biāo),文獻(xiàn)[15]中稀有鮈鯽胚胎不同時(shí)間的發(fā)育狀態(tài),在不同時(shí)間段(暴露染毒后12,24,36,48,60,72,84,96h)觀察并記錄胚胎發(fā)育過程中一些具有代表性的毒理學(xué)終點(diǎn)并進(jìn)行拍照.并統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組中稀有鮈鯽胚胎的孵化率、96hpf相對(duì)成活率、各時(shí)期畸形率(包括卵凝結(jié)、心包囊水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲、發(fā)育異常等).

1.5 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鯽胚胎發(fā)育到 96hpf時(shí),取出各實(shí)驗(yàn)組中存活的胚胎進(jìn)行CYP1A和p53 mRNA定量分析,每實(shí)驗(yàn)組中3個(gè)胚胎合并為1個(gè)樣品.使用RNAiso Plus試劑提取各組樣品中總RNA,用紫外分光廣度計(jì)測(cè)定其濃度和純度,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將等量的總 RNA反轉(zhuǎn)得到 cDNA.取1μLcDNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組胚胎中CYP1A和p53的表達(dá)情況.PCR反應(yīng)體系為50μL,其中Buffer為5μL,25mmol/L Mg2+4μL, 2.5mmol/L dNTP 2μL,10mmol/L上下游引物各2μL,Taq酶0.5U.以β-actin為內(nèi)參,CYP1A引物為5' AAAGCAATGGCTCTAACGG 3'和5' CGCAGGATAGGGATGAAAT 3',擴(kuò)增片段為 743bp, p53基因?yàn)?5' CCACCATGAGAGAACACCTGAT 3'和5'GCTGAGGAGCTTCATAGAGAACC 3', 擴(kuò)增片段為144bp,β-actin引物為5' CTACAGCTTCACCACCACA 3'和5' ATACCGCAAGATTCCATAC 3',擴(kuò)增片段為 231bp.PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性 10min;94℃變性 40s,56℃退火 30s, 72℃延伸40s,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 10min.PCR產(chǎn)物在 4℃冰箱保存,1%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照.用Quantity One軟件分析圖像.CYP1A和p53的mRNA定量結(jié)果以相同起始量的β-actin進(jìn)行校正,并以它們和β-actin電泳帶相對(duì)吸光度比值來(lái)表示.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

計(jì)算實(shí)驗(yàn)各組稀有鮈鯽胚胎的孵化率、96hpf相對(duì)成活率、各時(shí)期畸形率[16].所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.利用 SPSS 13.0軟件one-way ANOVA單因素方差分析比較處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性,P＜0.05表示差異顯著.同時(shí)對(duì)差異顯著的稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對(duì)存活率及各時(shí)期畸形率與PCP濃度之間進(jìn)行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

稀有鮈鯽受精卵呈半透明狀,易于觀察,在生物立體顯微鏡下可以清楚地觀察到胚胎各不同時(shí)期的發(fā)育情況.本實(shí)驗(yàn)共觀察了胚胎發(fā)育的 8個(gè)不同時(shí)期,空白正常組和PCP染毒組稀有鮈鯽胚胎各時(shí)期發(fā)育特征有明顯區(qū)別(表1).

表1 正常組和PCP染毒組稀有鮈鯽胚胎各時(shí)期發(fā)育特征Table 1 Developmental characteristics of normal and PCP exposed G. rarus embryos

圖1 不同濃度PCP處理后稀有鮈鯽胚胎發(fā)生畸變Fig.1 Deformation of G. rarus embryos after PCP treatment at different concentrations

各濃度 PCP處理后,稀有鮈鯽胚胎發(fā)育受到不同程度的影響,導(dǎo)致其胚胎和孵出幼魚產(chǎn)生各種畸形效應(yīng),結(jié)果見圖 1.從受精卵開始到PCP暴露12h,空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組稀有鮈鯽胚胎均未見異常癥狀,低濃度染毒組(＜30μg/L)發(fā)育也較正常,但高濃度染毒組(≥30μg/L)中則出現(xiàn)明顯的中毒癥狀,其中部分胚胎出現(xiàn)明顯卵黃渾濁或卵黃細(xì)胞被瓦解現(xiàn)象(圖 1A).正常稀有鮈鯽胚胎在囊胚期細(xì)胞高度分裂,但在強(qiáng)PCP毒性作用下,染毒組胚胎在進(jìn)入外包期前就停止發(fā)育,導(dǎo)致胚盤細(xì)胞損毀而發(fā)生卵凝結(jié).隨著 PCP染毒時(shí)間的增長(zhǎng),部分胚胎發(fā)育出現(xiàn)不規(guī)律的外包減少(圖1B)或胚胎發(fā)育一段時(shí)間后卵黃開始畸變(圖 1C).染毒 36h后,染毒組稀有鮈鯽胚胎出現(xiàn)胚中心包囊水腫現(xiàn)象(圖 1D),說(shuō)明 PCP進(jìn)入胚胎后影響了胚胎中血液循環(huán).染毒60h后,高濃度組未死亡的胚胎發(fā)育較正常組緩慢,而低濃度組胚胎已可見孵化雛形,部分胚胎在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)黑色素沉積較少(圖 2E).72h后,染毒稀有鮈鯽胚胎開始孵出,剛孵出的稚魚較正常組短,大部分為畸形,表現(xiàn)為脊柱彎曲(圖1F)、心包水腫(圖1G)、軀體彎曲(圖1H)、尾部彎曲(圖1I).96h時(shí),染毒組孵化的稀有鮈鯽幼魚行動(dòng)能力較弱,畸形加重出現(xiàn)死亡.隨著 PCP暴露的濃度的增加,稀有鮈鯽胚胎發(fā)育的延遲作用越明顯,且胚胎畸變的概率也增大.

2.2 稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對(duì)存活率和各時(shí)期畸形率

由圖2可見,在PCP暴露處理后,稀有鮈鯽胚胎的孵化率受到影響,并隨著 PCP濃度的升高而降低.空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組胚胎的孵化率都在 90%以上,PCP暴露各組稀有鮈鯽胚胎孵化率均有下降.當(dāng) PCP暴露濃度≥30μg/L時(shí),稀有鮈鯽胚胎的孵化率下降顯著(P＜0.05),并呈現(xiàn)一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系(表 2),其相關(guān)系數(shù)R2為0.974. PCP暴露濃度為250μg/L組時(shí),胚胎孵化率下降最為顯著(P＜0.01)僅為 10%,說(shuō)明胚胎在此高濃度 PCP暴露后,90%以上死亡.隨著 PCP暴露濃度的升高,稀有鮈鯽胚胎96hpf的相對(duì)成活率也逐漸降低.當(dāng)PCP暴露濃度≥30μg/L時(shí),胚胎的96hpf相對(duì)成活率均下降顯著(P＜0.05),呈現(xiàn)良好的濃度-效應(yīng)關(guān)系,R2＞0.98. 250μg/LPCP暴露組稀有鮈鯽胚胎的96hpf相對(duì)成活率接近于0(P＜0.01),說(shuō)明96hpf以后此濃度下幾乎所有稀有鮈鯽胚胎均死亡.經(jīng)過PCP暴露96h后,稀有鮈鯽胚胎的畸形率隨PCP濃度的增加而增加.當(dāng)暴露濃度≥60μg/L時(shí),胚胎的畸形率增加顯著(P＜0.05),與 PCP濃度呈現(xiàn)一定的效應(yīng)關(guān)系,R2為0.9567. PCP濃度達(dá)到 250μg/L時(shí),稀有鮈鯽胚胎的畸形率接近100%(P＜0.01). EE2陽(yáng)性暴露組胚胎的孵化率、96h相對(duì)存活率和各時(shí)期畸形率與對(duì)照組相比也有顯著差異,說(shuō)明 EE2也會(huì)影響稀有鮈鯽胚胎的發(fā)育.

圖2 不同濃度PCP和EE2暴露對(duì)稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對(duì)成活率及畸形率的影響Fig.2 Hatching rate, 96hpf relative survival rate and deformation rate of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2

2.3 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鯽胚胎發(fā)育到 96hpf時(shí),通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,PCP暴露各組胚胎中 CYP1A基因和抑癌基因 p53的mRNA表達(dá)量均隨 PCP濃度的升高而增加(圖3).CYP1A的半定量分析統(tǒng)計(jì)表明,空白、DMSO對(duì)照組及PCP、EE2各組胚胎中CYP1A表達(dá)量與β-actin基因的平均比值分別為:0.35、0.39、0.48、1.23、1.43、2.12、0.60(圖4).DMSO溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相比不明顯, CYP1A基因mRNA表達(dá)量均較低.而PCP暴露各組中,CYP1A基因 mRNA表達(dá)均顯著增加并均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.EE2暴露組中胚胎 CYP1A表達(dá)也增加顯著(P＜0.05).同時(shí)PCP暴露組中p53基因的表達(dá)量也隨PCP暴露濃度的升高逐漸增加(圖4).空白、DMSO對(duì)照組及PCP、EE2各組胚胎中p53表達(dá)量與 β-actin基因的平均比值分別為:1.50、 1.68、1.76、1.82、1.85、1.91、1.69.當(dāng)PCP≥30μg/L時(shí), p53基因mRNA表達(dá)量增加顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05.EE2同樣可以誘導(dǎo)胚胎中p53基因mRNA的表達(dá),但效應(yīng)不明顯.

表2 稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對(duì)存活率和畸形率與PCP的劑量效應(yīng)方程Table 2 Dose-response equation between hatching rate, relative survival rate, deformation rate and PCP concentration in G. rarus

圖3 CYP1A和p53基因mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 CYP1A and p53 expression after PCP exposure by RT-PCR

圖4 不同濃度PCP和EE2暴露組稀有鮈鯽胚胎CYP1A和p53mRNA表達(dá)定量結(jié)果(n=6)Fig.4 CYP1A and p53 mRNA levels of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2 by semi-quantitative RT-PCR

3 討論

PCP作為一種典型的水體污染物,可影響生物體的發(fā)育.蔣琳等[18]已發(fā)現(xiàn)PCP單獨(dú)暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育具有較強(qiáng)的毒性效應(yīng),可導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生各種畸形.本實(shí)驗(yàn)中通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),PCP對(duì)稀有鮈鯽胚胎同樣有顯著的毒性效應(yīng).在12～24 hpf期稀有鮈鯽胚胎發(fā)育即進(jìn)入分裂期,但PCP暴露染毒中的部分胚胎會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育阻滯和卵黃凝結(jié),從而影響稀有鮈鯽早期器官的形成,這些可作為稀有鮈鯽胚胎分裂期的致畸毒性終點(diǎn)指標(biāo).在 24～48hpf時(shí),稀有鮈鯽胚胎發(fā)育進(jìn)入成形期,血液循環(huán)系統(tǒng)逐漸成熟.此時(shí)部分PCP染毒胚胎可觀察到心包囊腫、心率不穩(wěn)等現(xiàn)象,它們同樣可以作為評(píng)價(jià)毒性作用的生理指標(biāo).在染毒 72～84hpf時(shí),低濃度染毒組開始孵化,但相對(duì)于空白和溶劑對(duì)照組已經(jīng)延遲,而高濃度組仍然發(fā)育緩慢,說(shuō)明稀有鮈鯽胚胎孵化時(shí)間的長(zhǎng)短可以反映毒性作用的強(qiáng)弱.在染毒96hpf時(shí),染毒組成活的稀有鮈鯽胚胎已全部孵化,可以觀察統(tǒng)計(jì)其孵化率、96hpf相對(duì)成活率和各時(shí)期畸形率.而稀有鮈鯽胚胎在PCP和EE2暴露染毒發(fā)育過程中,這3個(gè)指標(biāo)均與對(duì)照組有顯著差異,并與PCP濃度呈現(xiàn)明顯的效應(yīng)關(guān)系.

有研究[18-19]顯示,PCP暴露后斑馬魚胚胎發(fā)育過程中發(fā)展的fzd2、axin2等Wnt信號(hào)通路重要的調(diào)控基因表達(dá)均會(huì)發(fā)生顯著變化.而且應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),暴露于五氯酚的斑馬魚胚胎中有14個(gè)涉及細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)發(fā)生了顯著改變,說(shuō)明PCP可能對(duì)胚胎發(fā)育具有基因毒性而導(dǎo)致其畸變甚至死亡.CYP1A是細(xì)胞色素 P450超家族的重要成員,參與多種環(huán)境致癌物、致突變物的代謝[20].CYP1A在正常魚體內(nèi)組織的濃度很低,但在外來(lái)持久性有機(jī)污染物的誘導(dǎo)下,它的活性會(huì)升高.這主要是由于CYP1A基因的表達(dá)被污染物誘導(dǎo)劑高度誘導(dǎo),使其表達(dá)水平顯著增加[21].因此,魚類 CYP1A基因作為一種有效的生物標(biāo)志物已被廣泛的應(yīng)用于對(duì)環(huán)境污染物的評(píng)價(jià)[22-23].魚類胚胎發(fā)育時(shí)期對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物十分敏感,它們不僅能導(dǎo)致胚胎發(fā)育產(chǎn)生各種畸形,還能誘導(dǎo)胚胎組織中 CYP1A的表達(dá),可見內(nèi)分泌干擾物對(duì)CYP1A的誘導(dǎo)與其毒性作用密切相關(guān)[24].而p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因, 50%以上的腫瘤發(fā)生都與p53基因的突變或功能的失調(diào)有關(guān)[25].在正常生理狀況下,p53表達(dá)水平很低,當(dāng)受到外界環(huán)境刺激后,p53表達(dá)水平會(huì)升高[26],因此p53基因可作為環(huán)境污染物潛在致癌性的生物標(biāo)志物.本研究中以稀有鮈鯽胚胎為研究對(duì)象,利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn) PCP和 EE2可以誘導(dǎo)其中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達(dá),并隨PCP濃度的增加而升高具有顯著效應(yīng),進(jìn)一步驗(yàn)證了PCP對(duì)胚胎發(fā)育的基因毒性作用,對(duì)于揭示其致癌性和致畸性機(jī)理有一定幫助.

4 結(jié)論

4.1 PCP和EE2能夠影響稀有鮈鯽胚胎的發(fā)育,造成胚胎畸形發(fā)育遲緩、孵化率和96hpf相對(duì)成活率下降、畸形率增加.

4.2 PCP暴露染毒可以誘導(dǎo)稀有鮈鯽胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達(dá),并隨PCP濃度的升高而增加具有顯著的效應(yīng).

4.3 利用稀有鮈鯽胚胎發(fā)育評(píng)價(jià)PCP和EE2的致毒和致畸效應(yīng)是可行的,對(duì)發(fā)現(xiàn) PCP 的毒性作用機(jī)制、毒性敏感性及其在水體污染中的監(jiān)測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義.

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Toxic effects of pentachlorophenol on the Chinese rare minnow embryos.

XIONG Li1, MA Yong-peng2, MAO Si-yu1, SU Yong-liang1, JIN Bang-ming1, LIU Yan1*(1.Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2.Clinical Laboratory Center of Chongqing, Laboratory of the Third People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400016, China). China Environmental Science, 2012,32(2)：337～344

The carcinogenicity and toxicity of pentachlorophenol (PCP) exposure on the Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) embryos were investigated. G. rarus embryos at 0 hour past fertilization (hpf) were exposed to PCP at different concentrations (0, 7.5, 30, 60, 120, 250μg/L). DMSO(＜0.01%,V/V) and 17α-ethynylestradiol (EE2, 2.5ng/L) were set as solvent control and positive control, respectively. The embryonic development was observed under the stereomicroscope. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, and deformity rate through the entire embryos developmental process were calculated. Furthermore, the mRNA expressions of CYP1A and p53 gene were analyzed by semi-quantitatively RT-PCR. PCP exposure resulted in delayed embryonic development, condensation of embryonic eggs, formation of pericardial cysts, curvature of the spine or even death. The hatching rate and relative survival rate at 96 hpf were reduced while deformity rate were increased in a dose dependent manner of PCP. The mRNA level of CYP1A and p53 in embryos also were significantly up-regulated with increasing PCP concentration. PCP had significant toxic effects on G. rarus embryos. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, malformation rate, CYP1A and p53 expression levels can be used as sensitive biomarkers to evaluate the toxic effects of PCP exposure on fish embryos.

Gobiocypris rarus；embryonic development；pentachlorophenol；toxic effects；CYP1A；p53

2011-05-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21147002);國(guó)家“973”項(xiàng)目(2012CB723205);三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究基金;重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CSTC.2009BB1131)

* 責(zé)任作者, 教授, liuyan@swu.edu.cn

X503.225

A

1000-6923(2012)02-0337-08

熊 力(1985-),男,湖北隨州人,西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué).發(fā)表論文2篇.