硝基還原假單胞菌谷氨酰胺酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)*

楊成，張濤，江波，繆銘，沐萬(wàn)孟，馬亞君，張薇

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

谷氨酰胺酶 (glutaminase，EC 3.5.1.2，GA)是一種催化L-谷氨酰胺(L-Gln)水解成L-谷氨酸和氨的酰胺酶，廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)及細(xì)菌、真菌等微生物中［1-2］。谷氨酰胺酶是食品工業(yè)中的一種重要酶制劑，是一種既有水解活力又有轉(zhuǎn)移活力的多功能酶。一些微生物來(lái)源的谷氨酰胺酶因具有轉(zhuǎn)移活力，可以催化谷氨酰胺的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備一種功能性食品添加劑——茶氨酸。

茶氨酸(L-theanine)是茶葉特有的一種氨基酸，是茶葉中有效的呈味物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血壓、提高學(xué)習(xí)能力、抗疲勞、神經(jīng)保護(hù)和提升免疫力等多種生理功能［2］。目前，微生物發(fā)酵法制備茶氨酸已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，其主要應(yīng)用的酶制劑有谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)和谷氨酰胺酶。其中，有關(guān)于谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)已有較多報(bào)道，主要有賈曉鶴等人［3］和王春暉等人［4］利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和帥玉英等人［5］自主篩選出的GGT高產(chǎn)菌株制備谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成茶氨酸。谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸的報(bào)道主要有王春暉等人［4］報(bào)道的利用硝基還原假單胞菌細(xì)胞生物合成茶氨酸，但國(guó)內(nèi)有關(guān)于谷氨酰胺酶酶法制備茶氨酸以及谷氨酰胺酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的報(bào)道卻較為少見(jiàn)。

本文主要研究硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所產(chǎn)的谷氨酰胺酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步研究酶的催化機(jī)制及其在茶氨酸酶法制備中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種:硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

主要試劑:L-谷氨酸-γ-單羥肟酸，Sigma公司;Hiprep DEAE FF 16/10，美國(guó) GE公司;Superdex 75 10/300 GL，美國(guó)GE公司;考馬斯亮藍(lán)R250，上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝;(NH4)2SO4，上海化學(xué)試劑公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏3，NaCl 5，瓊脂15，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基 (g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏3，NaCl 5，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):蔗糖5，谷氨酸鈉6，酵母膏1，MgSO4·7H2O 0.7，K2HPO40.5，KH2PO40.5，EDTA-Fe 0.1，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

?kta purifier 100蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，GE公司;10 kDa截留量超濾膜，Millipore公司;混合纖維樹(shù)脂微孔濾膜(0.45 μm)，上海新亞凈化儀器廠;DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;721E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)及酶的提取

取2環(huán)斜面種子接入到種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min下培養(yǎng)14 h后接入裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%，于同樣條件下培養(yǎng)21 h。發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基在4℃，10 000 r/min離心10 min，得到濕菌體，將菌體用pH 7.0，10 mmol/L的K3PO4緩沖液重懸后超聲破碎30 min(工作1s，暫停2s)，于10 000 r/min，4℃離心10 min即得粗酶液。

向粗酶液中加入70%(NH4)2SO4，于4℃靜置4 h，9 000 r/min離心除去雜蛋白，再向溶液中繼續(xù)加入(NH4)2SO4至濃度為80%，4℃靜置12 h后離心得到酶蛋白沉淀。沉淀用少量pH 7.5，10 mmol/L的K3PO4緩沖液溶解后透析24 h，以除去其中的透析好的酶液通過(guò)DEAE-fast flow離子交換柱和Superdex 75凝膠柱進(jìn)行分離純化，采用?kta蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，最終得到目的蛋白。多次重復(fù)純化步驟，將收集到的純酶液進(jìn)行冷凍干燥，用于測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)。

1.3.2 Hiprep DEAE-FF 16/10離子交換層析

Hiprep DEAE-FF 16/10弱陰離子交換柱 (φ1.6 cm×10 cm)用起始緩沖液(10 mmol/L，pH7.5的K3PO4緩沖液)平衡10個(gè)柱體積后，上樣1 mL，沖洗2個(gè)柱體積后，用含有0～1 mol/L NaCl的起始緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫5個(gè)柱體積，流速保持在2 mL/min。二次層析時(shí)，使用線性洗脫5個(gè)柱體積，其他條件同上。

1.3.3 Superdex 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析

Superdex 75 10/300 GL凝膠柱用含0.15 mol/L NaCl的10 mmol/L，pH 7.0的磷酸鉀緩沖溶液平衡5個(gè)柱體積。濃縮DEAE活性峰后，上樣0.5 mL，用同樣的溶液洗脫1.5個(gè)柱體積，流速為0.5 mL/min。

1.3.4 SDS-PAGE電泳

分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和4%，操作電流為20 mA，上樣量10 μL，電泳完畢后，用12%的三氯乙酸固定，考馬斯亮藍(lán)染色2 h后脫色。

1.3.5 酶活測(cè)定方法

比色法測(cè)定酶活［6］:根據(jù)谷氨酰胺酶可以將谷氨?；D(zhuǎn)移到鹽酸羥胺上得到L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的原理［10］，在 1 mL，100 mmol/L 咪唑-HCl(pH 9.0)緩沖溶液的酶活測(cè)定體系中，含35 mmol/L的谷氨酰胺 (L-Gln)和150 mmol/L的鹽酸羥胺，加入150 μL酶液，于30℃下反應(yīng)15 min，加入2 mL終止液(10%FeCl3∶24% 三氯乙酸∶6 mol/L HCl∶水 =8∶2∶1∶13)，測(cè)定540 nm下的吸光度。酶活力單位定義為1 min生成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。

1.3.6 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

采用Lowry法［7］，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.7 GA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

將酶液分別在 30、37、40、50、55、60、70℃，pH 9.0的條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，得到不同溫度下的相對(duì)酶活，確定谷氨酰胺酶的最適反應(yīng)溫度。

將酶液分別在 30、37、40、50、55、60、70℃下保存4 h，每隔一定時(shí)間取樣，在最適溫度，pH 9.0的條件下測(cè)定殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶液的酶活為100%，得到相對(duì)酶活并作圖。

1.3.8 GA的最適pH及pH穩(wěn)定性

將酶液分別用不同pH緩沖液調(diào)至pH 5.0～11.0，在55℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定酶活，以最適pH下的酶活為100%，確定谷氨酰胺酶的最適反應(yīng)pH。

將酶液分別在pH 5.0～11.0的緩沖液中保存12 h，在55℃、pH 9.0條件下測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，得到相對(duì)酶活并作圖。

1.3.9 金屬離子對(duì)GA酶活的影響

酶液在含5 mmol/L EDTA的K3PO4緩沖液中透析12 h，除去金屬離子后于不含EDTA的緩沖液中4℃透析24 h除去殘留EDTA。在處理后的酶液中分別加入不同的金屬離子 (Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+，離子終濃度分別為0.2 mmol/L和2 mmol/L)，并于4℃，pH 9.0條件下保溫1 h后測(cè)定殘余酶活，以不添加金屬離子或化合物的酶液活力為100%。

1.3.10 GA的底物專(zhuān)一性

實(shí)驗(yàn)采用多種γ-谷氨?；w［6］代替酶活測(cè)定方法中的L-Gln，其他反應(yīng)條件不變，測(cè)定酶活，考察谷氨酰胺酶對(duì)不同谷氨酰供體的親和力，以L-Gln為供體時(shí)的酶活力為100%。

1.3.11 GA酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

考察L-Gln，鹽酸羥胺酶活測(cè)定體系中，底物L(fēng)Gln的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。分別配制0.5～25 mmol/L不同濃度的底物溶液，測(cè)定酶活，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計(jì)算GA的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷氨酰胺酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果

由圖1可以看出，(NH4)2SO4飽和度達(dá)到80%時(shí)，沉淀級(jí)分的比酶活最高，因此先用70%飽和度的(NH4)2SO4沉淀除去大部分雜蛋白，然后增加(NH4)2SO4的飽和度到80%，收集沉淀級(jí)分。

圖1 硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果

2.1.2 DEAE離子交換層析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］，谷氨酰胺酶的等電點(diǎn)一般在5.5～7.5左右，pH穩(wěn)定范圍在5.5～8.0，因此選擇弱陰離子交換柱DEAE-Sepharose fast flow對(duì)GA進(jìn)行分離純化。圖2顯示，酶活主要集中在洗脫體積為75～93 mL的峰中，GA主要在0.3～0.5 mol/L NaCl范圍內(nèi)被洗脫下來(lái)。為進(jìn)一步純化，將活性峰濃縮后再次上樣。

圖2 GA的DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析圖

由圖3可以看出，活性峰中的酶蛋白，進(jìn)一步洗脫后得到4個(gè)蛋白峰，分別測(cè)定酶活后，發(fā)現(xiàn)酶蛋白主要集中于0.3～0.4 mol/L的洗脫梯度中，其他3個(gè)峰未測(cè)到酶活。經(jīng)兩次離子交換層析后，除去大量的雜蛋白，酶被純化了2.6倍，回收率為19.53%。

圖3 GA的二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析圖

2.1.3 凝膠過(guò)濾層析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］，微生物谷氨酰胺酶的分子質(zhì)量范圍多在25～67 ku，因此實(shí)驗(yàn)采用排阻范圍在3～70 ku的Superdex 75 10/300 GL凝膠柱，在洗脫體積為9～11 mL處得到單一活性峰，通過(guò)酶活檢測(cè)收集活性峰，回收率為9.33%，純化倍數(shù)為4.14倍。由圖4出峰結(jié)果，可估計(jì)目的蛋白的分子質(zhì)量大約在41 kDa左右。

圖4 GA的Superdex 75 10/300 GL凝膠層析色譜圖

2.1.4 純化各步驟酶活回收率

由表1可知，粗酶液經(jīng)過(guò)各步純化后，比酶活提高到0.949 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到4.14倍。

表1 GA的分離純化結(jié)果

2.1.5 SDS-PAGE電泳

將分離純化后的組分分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖5所示。純化后的樣品呈單一條帶，達(dá)到電泳純度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量計(jì)算，該酶的分子質(zhì)量約為41ku，與凝膠柱分析結(jié)果一致。

2.2 GA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

圖5 不同純化階段酶活組分SDS-PAGE電泳圖

由圖6可知，該酶的最適反應(yīng)溫度在55℃左右，在37～60℃內(nèi)保持較高的活性，酶的相對(duì)活力保持在70%以上。其最適溫度與Weingand-Ziadé等人［8］報(bào)道的50℃和 Durá等人［9］報(bào)道的 40℃較為接近(表4)。

圖6 GA的最適反應(yīng)溫度

由圖7可知，GA具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在30～55℃保溫4 h后，酶活保持在80%以上，基本沒(méi)有損失;而在溫度高于60℃，保溫0.5 h時(shí)，酶活損失嚴(yán)重;至70℃時(shí)，酶活下降了近90%。

圖7 GA的溫度穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)GA最適溫度和溫度穩(wěn)定性的研究，有助于確定制備茶氨酸的酶反應(yīng)條件。在茶氨酸的制備過(guò)程中可以通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇30℃，40℃，50℃及55℃進(jìn)行最適反應(yīng)溫度的研究。

2.3 GA的最適pH值及pH穩(wěn)定性

由圖8可知，酶反應(yīng)的最適pH為9.0，在pH為5.0～11.0時(shí)，酶活保持在80%以上，具有廣泛的最適pH值范圍，其最適 pH與 Tachiki等人［6］報(bào)道的pH 9.0和Durá 等人［9］報(bào)道的 pH 8.5 接近，綜合其他研究結(jié)果(表4)可知，微生物來(lái)源的GA的最適pH 多偏堿性［11］。

圖8 GA最適反應(yīng)pH

由圖9可知，GA在pH 5.0～11.0內(nèi)酶活基本保持穩(wěn)定，其耐酸耐堿能力比Tachiki等人［6］報(bào)道的pH 5.5～8.0要高。

圖9 GA的pH穩(wěn)定性

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)可證明該酶在堿性條件下活力高且保持穩(wěn)定，適宜進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備茶氨酸。本實(shí)驗(yàn)室同樣測(cè)定出，利用GA生產(chǎn)茶氨酸的反應(yīng)體系最適pH為9.5與該酶的最適pH接近。

2.4 金屬離子對(duì)GA酶活的影響

金屬離子的加入一方面可以改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，對(duì)蛋白質(zhì)鏈上氨基酸的電離造成影響，從而改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，另一方面許多金屬離子是某些復(fù)合蛋白酶的輔助因子，會(huì)對(duì)酶的活性位點(diǎn)產(chǎn)生影響，所以金屬離子的加入會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響(見(jiàn)表2)。

由表2可知，在10種金屬離子中，不同濃度的Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ba2+、Ca2+對(duì) GA 的酶活影響不明顯，Cu2+、Mg2+、Fe2+可以提高 GA 轉(zhuǎn)移活力，且隨著濃度的增高，Cu2+對(duì)促進(jìn)酶活提高作用最大，與Tachiki等人的研究結(jié)果相似［6］。EDTA會(huì)輕微抑制酶活，而添加Fe3+會(huì)降低34.38%的轉(zhuǎn)移活力。

表2 金屬離子對(duì)酶活的影響

2.5 GA的底物專(zhuān)一性

多數(shù)研究結(jié)果顯示GA具有很強(qiáng)的底物專(zhuān)一性，L-Gln是GA催化的最好底物。此外，部分微生物來(lái)源的微生物也可以催化D-Gln、L-天冬酰胺和D-天冬酰胺的水解［1］。因此本文對(duì)硝基還原假單胞菌所產(chǎn)GA的底物專(zhuān)一性進(jìn)行了研究結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 谷氨酰胺酶的底物專(zhuān)一性

由表3可知，GA對(duì)L-Gln的親和力最強(qiáng)，具有很好的專(zhuān)一性。對(duì) γ-谷氨酰-對(duì)硝基苯胺 (含芳香基團(tuán))的親和力較弱，分析原因可能是空間位阻的大小影響酶與底物的親和力。而GA與谷氨酸鈉、谷氨酸、天冬酰胺的親和力極弱。結(jié)果表明，GA主要具備谷氨?；霓D(zhuǎn)移活力，而對(duì)其他氨基酸基團(tuán)或天冬?；霓D(zhuǎn)移活性極弱。該結(jié)果與Tachiki等人［6］的研究結(jié)果不同，GA的底物專(zhuān)一性更好，分析原因可能是酶的空間結(jié)構(gòu)與特殊位點(diǎn)存在差異，從而產(chǎn)生不同的立體異構(gòu)專(zhuān)一性。

由于GA對(duì)L-Gln的高度專(zhuān)一性，可以初步確定將L-Gln作為茶氨酸制備過(guò)程中最適的谷氨?；w。

2.6 GA酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響速度的各種因素的科學(xué)。動(dòng)力學(xué)研究既可以為酶的機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，又可以指導(dǎo)酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用，以最大限度地發(fā)揮酶的催化作用。Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)、酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無(wú)抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，繪制酶作用于L-Gln的動(dòng)力學(xué)曲線，以圖10中橫坐標(biāo)的截距為-1/Km，縱坐標(biāo)的截距為1/Vmax，根據(jù)回歸方程計(jì)算，得到谷氨酰胺酶對(duì)底物 (L-Gln)的Km值為0.72 mmol/L，對(duì)底物 (L-Gln)的 Vmax為 0.55 μmol/(min·mL)。表4列出了部分不同來(lái)源的GA的性質(zhì)比較。

圖10 GA的Lineweaver-Burk圖

表4 不同來(lái)源的谷氨酰胺酶的性質(zhì)比較［11－12］

由表4可知，不同菌種谷氨酰胺酶的性質(zhì)有所不同，其中P.Nitroreducens SK16.004與E.coli所產(chǎn)GA的相對(duì)分子量和最適pH相差較大，但對(duì)于反應(yīng)底物Gln的Km值較為接近［12］。來(lái)自假單胞菌屬不同菌株所產(chǎn)的GA，雖最適pH與相對(duì)分子量較為接近，但在耐熱性和Km值上有較大差別［6］。但酵母菌屬的De-baryomyces［9］與乳桿菌屬的 Lactobacillus［10］雖來(lái)源不同，但在酶學(xué)性質(zhì)如最適溫度、pH和Km值等多方面具有相似之處。

3 結(jié)論

(1)采用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾等純化方法，獲得了硝基還原假單胞菌谷氨酰胺酶，純化倍數(shù)為4.14，回收率為9.33%。通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度，得到單一條帶，即純化后樣品達(dá)到電泳純，谷氨酰胺酶的相對(duì)分子量約為41 ku。

(2)硝基還原假單胞菌SK16.004谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)移酶活的最適溫度為55℃，溫度在37～60℃范圍內(nèi)時(shí)，酶殘余活力在70% 以上。該酶的最適pH為9.0，在pH 5.0～11.0時(shí)，轉(zhuǎn)移酶活保持穩(wěn)定。

(3)在 10 種金屬離子中，Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ba2+對(duì) GA 的酶活影響不明顯，Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+可以提高GA轉(zhuǎn)移活力，其中Cu2+對(duì)促進(jìn)酶活提高作用最大。EDTA會(huì)輕微抑制酶活，而添加Fe3+會(huì)降低34.38%的轉(zhuǎn)移活力。

(4)GA對(duì)不同的底物 γ-谷氨酰-對(duì)硝基苯胺(含芳香基團(tuán))、谷氨酸鈉、谷氨酸、天冬酰胺的親和力較弱，而對(duì)L-Gln的親和力最強(qiáng)，具有很高的底物專(zhuān)一性。

(5)以L-Gln為底物，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖得到 GA的 Km值為0.72 mmol/L，Vmax為0.55 μmol/(min·mL)。

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