近紅外光譜技術(shù)在激光熱療荷瘤大鼠中的實時監(jiān)測研究

王猛，游洋，楊天明，錢志余，包美芳

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇南京 210009;2.南京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，江蘇南京 210016)

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，廣義膠質(zhì)瘤是指所有神經(jīng)上皮來源的腫瘤，而組織病理學(xué)上則狹義地指來源于各類膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤。雖然臨床上膠質(zhì)瘤的治療有手術(shù)、化療、放療、基因、免疫、光動力、熱療、中醫(yī)藥等多種手段［1］，但其總體預(yù)后仍不容樂觀。腫瘤激光間質(zhì)熱療(laser interstitial thermotherapy，LITT)是將激光通過光纖導(dǎo)入到腫瘤組織內(nèi)部并從加入頭表面發(fā)出，腫瘤組織吸收激光能量而被加熱，由于過熱和凝結(jié)效應(yīng)而壞死［2］。世界范圍內(nèi)有少數(shù)醫(yī)療中心已經(jīng)將LITT作為腦腫瘤治療方法之一應(yīng)用于臨床［3-6］。本研究將近紅外光譜(NIRS)技術(shù)應(yīng)用于LITT大鼠膠質(zhì)瘤并行術(shù)中實時監(jiān)測，通過分析NIRS光學(xué)參數(shù)，尤其是優(yōu)化散射系數(shù)(μ's)的變化情況，對膠質(zhì)瘤的LITT治療進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

德國LIMO公司半導(dǎo)體激光器電源及CA系列高功率半導(dǎo)體激光器、fNIRS監(jiān)測系統(tǒng)［7］、7.0 T小動物MRI、自動步進(jìn)系統(tǒng)、計算機及相關(guān)軟件。

1.2 細(xì)胞和動物

SD健康大鼠100只，體重180～220 g，雌雄不限(購自南京青龍山實驗動物中心)。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將C6細(xì)胞分裝于底面積為50 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，置于溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，單層培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)生長至所需的細(xì)胞數(shù)。在細(xì)胞對數(shù)生長期大約滿90%時，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次后制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度［1×107(10μl)-1～1×108(10μl)-1］，置于34℃恒溫?fù)u床待接種。苔盼藍(lán)排斥實驗檢測細(xì)胞活力＞95%。

1.3.2 腫瘤接種 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(45 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉。麻醉后將大鼠固定于小動物實驗臺上，0.5%碘伏左前腋下局部消毒，25μl微量進(jìn)樣針將20μl細(xì)胞懸液穿刺成功后緩慢注入血供豐富的左前腋區(qū)皮下間隙，注射完畢后無菌敷料覆蓋。

1.3.3 MRI成像 術(shù)后1～2周行7.0 T磁場強度MRI掃描，觀察腫瘤生長情況。

1.3.4 近紅外光學(xué)參數(shù)μ's的測定 將建模成功后的膠質(zhì)瘤大鼠隨機分為非 LITT 30、60、90、120 s，0.77 W(8.3 A)30、60、90、120 s，1.23 W(8.8 A)30、60、90、120 s，1.88 W(9.5 A)30、60、90、120 s，2.35 W(10 A)30、60、90、120 s組，共20 組，每組 5 只。荷瘤大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉，常規(guī)消毒后切開皮膚約1.0 cm，剝離皮下組織，分離出膠質(zhì)瘤并切開0.5 cm，將固定于步定進(jìn)機的激光光纖探頭與近紅外探頭一同緩慢步進(jìn)入腫瘤，開啟近紅外光源，根據(jù)分組情況予以808 nm LITT(非LITT組不予只記錄相應(yīng)時間內(nèi)的μ's值)，記錄腫瘤在LITT前及過程中μ's的變化，測量結(jié)束后緩慢退出激光光纖探頭與近紅外探頭，常規(guī)消毒縫合傷口，整個過程在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，術(shù)后予以抗生素防治感染，次日對手術(shù)大鼠再次行7.0 T磁場強度的小動物專用MRI掃描。MRI掃描后斷頭處死大鼠，取腫瘤固定于4%多聚甲醛溶液3 d，石蠟包埋，HE常規(guī)染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0及Excel軟件進(jìn)行分析，行單因素或兩因素多樣本均數(shù)比較的方差分析，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建模后大鼠臨床表現(xiàn)

大鼠左上肢皮下可見一逐漸增大類圓形腫物，質(zhì)硬，活動度好;大鼠左上肢活動輕微受限，進(jìn)水進(jìn)食無明顯異常，二便無明顯異常，體重未見明顯減輕，行為無明顯異常。

2.2 術(shù)前MRI及病理檢查結(jié)果

經(jīng)7.0 T磁場強度的小動物專用MRI掃描，T2像可見大鼠左上腋皮下一直徑約1.5 cm類圓形高信號影(圖1a)。取膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行HE染色，可見膠質(zhì)瘤細(xì)胞輕度藍(lán)染，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞排列紊亂(圖1b)。

2.3 LITT過程中μ's的測定結(jié)果

2.3.1 非LITT組μ's的變化 該組內(nèi)荷瘤大鼠的μ's在操作過程中保持平穩(wěn)，無明顯波動變化。

2.3.2 0.77、1.23、1.88、2.35 W μ's組 μ's的變化LITT前μ's保持平穩(wěn)，為記錄其平穩(wěn)值，LITT開始后μ's首先出現(xiàn)瞬間小幅下降，預(yù)置程序剔除808 nm激光干擾，然后平緩地上升，熱療結(jié)束時μ's達(dá)峰值，隨后μ's保持平穩(wěn)或緩慢下降。

2.3.3 各組荷瘤大鼠LITT前后μ's的變化值比較荷瘤大鼠μ's會因腫瘤物質(zhì)的組成不同即病理分級不同而有所差別［11］，所以采用μ's的變化值來進(jìn)行分析，定義變化值為:每只荷瘤大鼠熱療過程中μ's的峰值與該大鼠LITT手術(shù)前初始狀態(tài)的均值的差值，采用5只大鼠變化值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示不同組別的光學(xué)參數(shù)變化情況。由于非熱療組無峰值出現(xiàn)，故不納入統(tǒng)計分析，用“—”表示(表1)。

圖1 大鼠建模成功后影像學(xué)及病理學(xué)表現(xiàn)Fig 1 Tumor imaging and pathological manifestations

表1 荷瘤大鼠LITT前后μ's的變化cm-1Tab 1 The changes ofμ's before and after LITT for rats with glioma cm-1

結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析:同一功率下不同時間組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);同一時間下不同功率組間兩兩比較，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 LITT后荷瘤大鼠的影像學(xué)及病理學(xué)圖像

術(shù)后第2天使用小動物專用7.0 T MRI掃描，各組可見明顯片狀類圓形壞死灶，T2WI表現(xiàn)為腫瘤中心低信號影，低信號灶周圍信號略有升高，水腫帶形成(圖2a)。行MRI后取膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行HE染色，可見腫瘤中心形成明顯壞死灶，表現(xiàn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞完全變性壞死，胞核消失，胞質(zhì)空泡化;其外為反應(yīng)區(qū)，胞膜較完整，腫瘤結(jié)構(gòu)依稀可見，周圍有水腫形成(圖2b)。

圖2 荷瘤大鼠LITT后影像學(xué)及病理學(xué)表現(xiàn)Fig 2 Imaging and pathological manifestations of tumor after LITT

2.5 LITT后荷瘤大鼠壞死灶體積

經(jīng)病理學(xué)驗證，可以將連續(xù)掃描影像學(xué)的最大壞死灶直徑測量值作為壞死灶的直徑D(D=2R)，同時測量得壞死灶的高H。利用公式V=4πR2H/3=πD2H/6計算獲得壞死灶體積，體積的數(shù)據(jù)見表2。

表2 荷瘤大鼠LITT壞死灶體積mm3Tab 2 The volume of necrosis after LITT for rats with glioma mm3

統(tǒng)計結(jié)果分析:相同熱療功率下，不同時間組間兩兩比較，熱療壞死灶體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，相同熱療時間下，不同功率組間兩兩比較，熱療壞死灶體積差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

LITT已經(jīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療，LITT的功率、時間直接影響治療效果及預(yù)后［8-10］，對LITT的術(shù)中實時監(jiān)測是十分必要的，因此我們將NIRS技術(shù)應(yīng)用于LITT大鼠膠質(zhì)瘤，研究NIRS對膠質(zhì)瘤LITT進(jìn)行實時監(jiān)測的可行性。生物組織對于近紅外區(qū)域的光(700～1 200 nm)具有相對的透明性，利用近紅外波段光對組織的良好通透性及在不同組織的光學(xué)差異性，有望達(dá)到對組織結(jié)構(gòu)精確定性、精準(zhǔn)測量、精細(xì)定位的目的［11-12］。光子進(jìn)人體組織后主要與組織發(fā)生以下相互作用:(1)吸收，從而導(dǎo)致能量在組織中的喪失，表征這一作用的光學(xué)參數(shù)稱為吸收系數(shù)(absorbtion coefficient，μα);(2)散射，發(fā)生在介質(zhì)的邊界，如與神經(jīng)活動相關(guān)的神經(jīng)元的膜表面，是由于在顯微水平上組織中各組成成分的折射率不連續(xù)所致，表征這一作用的光學(xué)參數(shù)稱為 μ's，它表示散射事件發(fā)生的頻率，或者單位路徑內(nèi)光子因散射而損失的光能量的比率。由于吸收和散射的作用，光在通過組織后其強度會減小，削減的程度與所通過組織的吸收系數(shù)和 μ's的大小有關(guān)，因此可以說漫反射或透射光中攜帶著大量的生物組織結(jié)構(gòu)和成分的信息［13］，從漫反射或透射光的光譜信息中了解光在組織中被吸收和散射的情況，從而解算出組織的 μα和 μ's等光學(xué)參數(shù)，這正是NIRS技術(shù)的理論基礎(chǔ)［14］。運用NIRS技術(shù)監(jiān)測各功率、時間下 LITT過程中腫瘤組織μ's的變化規(guī)律，并對其加以分析。相同時間、不同功率下，μ's的變化值隨功率變化較明顯，提示組織受損程度不同，術(shù)后通過病理學(xué)及影像學(xué)檢查測得壞死灶的體積及程度確實存在差異，即μ's變化值的大小對應(yīng)不同的組織損傷程度。相同功率、不同時間下，μ's的變化值隨時間延長而增大，壞死灶的體積也隨之增大，提示熱療時間越長腫瘤組織壞死程度越嚴(yán)重。對各組μ's數(shù)據(jù)、壞死灶體積數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，功率不變時，各時間組之間存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，時間不變時，各功率組之間亦存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

MRI、B超等設(shè)備雖可用于LITT術(shù)中實時監(jiān)測，但靈活性及準(zhǔn)確性差，故較少用于術(shù)中實時監(jiān)測。劉華亭等［15］證實NIRS參數(shù)(μ's)變化與大鼠膠質(zhì)瘤射頻毀損的溫度、時間具有相關(guān)性，本實驗提示升高功率和延長時間μ's發(fā)生了明顯的變化，相對應(yīng)的探頭周圍腫瘤組織的壞死體積也發(fā)生了明顯的變化，μ's很好地反映了LITT壞死體積的變化情況，故能作為LITT實時監(jiān)測的一個良好指標(biāo)。

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