奧曲肽聯(lián)合NSAIDs對結(jié)腸癌細胞生長的影響及作用機制＊

孫振海， 杜寒松， 龍躍平， 李 穎， 張 慶

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胃腸外科，武漢 430022

結(jié)腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有增加的趨勢。研究報道長期服用非甾體類抗炎藥物（non－steroid anti－inflammatory drugs，NSAIDs）可以有效減少結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病風險［1－4］。塞來昔布（Celecoxib）是一種高選擇性環(huán)氧合酶－2（COX－2）抑制劑，其表現(xiàn)出來的抗腫瘤作用引起了眾多學者的關(guān)注。但有研究表明，用Celecoxib 對胃癌細胞進行干預時，Celecoxib能誘導胃癌細胞產(chǎn)生未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），主要表現(xiàn)在UPR 的標志分子BiP（immunoglobulin heavy chain binding protein in pre－B cells）表達量上調(diào)，從而削弱Celecoxib 誘導腫瘤細胞凋亡的作用［5］。奧曲肽（octreotide，OCT）是一種人工合成的長效生長抑素類似物。其生物學活性明顯強于天然生長抑素，且作用時間更加持久。大量臨床和基礎研究均表明，OCT 不僅能抑制多種內(nèi)分泌激素分泌，而且具有抑制多種腫瘤細胞增殖的功能，很多臨床實驗已將其與其它化療藥物進行聯(lián)用，觀察其對傳統(tǒng)化療藥物的協(xié)同作用［6－11］。但OCT 抑制腫瘤細胞生長的具體機制目前仍不太清楚。本研究擬將OCT 與Celecoxib聯(lián)合應用，處理人結(jié)腸癌細胞SW480，觀察OCT 能否增強Celecoxib的抗癌作用，并探討其作用機制是否是通過抑制Celecoxib誘發(fā)的UPR 而實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人結(jié)腸癌細胞SW480由本科室保存。兔抗人BiP單克隆抗體購自Epitomics公司。HRP標記的羊抗兔IgG 購自ProteinTech Group公司。鼠抗人β－actin單克隆抗體及HRP標記的羊抗鼠IgG 購自武漢博士德公司。CCK－8購自碧云天公司。PI及RnaseA 購自Sigma公司。Annexin Ⅴ－FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自Bender Medsystems公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。DMED 高糖培養(yǎng)液購自HyClone公司。Celecoxib購自武漢威順達科技發(fā)展有限公司。OCT 由上海諾華貿(mào)易有限公司贈與。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細胞長至80%～90%融合時用于實驗。

1.3 CCK－8檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞100μL 接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，貼壁生長12h，根據(jù)預實驗結(jié)果擬采用下列藥物濃度和分組：空白對照組，Celecoxib單藥組（80μmol／L），聯(lián)合用藥組（80μmol／L Celecoxib分別加0.25、0.5、1、2mg／L OCT），OCT單藥組（0.25、0.5、1、2 mg／L）。每組設3 個復孔。Celecoxib溶于DMSO 中，細胞培養(yǎng)液中DMSO 的濃度為0.1%。分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入CCK－8溶液5μL，2h后用酶標儀于450nm 波段測定其吸光度值。以各組細胞與空白對照組吸光度比值反映細胞相對增殖能力。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板中，每孔約3×105個細胞，貼壁生長24h后按上述1.3項分組加藥，作用12h后，離心收集細胞，1 500r／min離心5min，棄培養(yǎng)液。用冷PBS 洗滌細胞2 次。用400μL 1×Binding buffer懸浮細胞，密度大約為1×106／mL。在細胞懸浮液中加入5μL AnnexinⅤ－FITC，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10μL PI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5min。在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

同1.4項培養(yǎng)、干預和收集細胞。用PBS洗滌細胞1 次。用－20℃預冷的75%乙醇固定過夜。離心收集細胞，1 000r／min離心5min，PBS洗滌細胞1次，盡可能去除上清。加入1mL 預混的DNA染液，其中PI工作濃度為100μg／mL，RnaseA 工作濃度為20μg／mL。4℃避光反應30min即上機檢測。

1.6 Western blot檢測BiP蛋白表達

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板中，每孔約3×105個細胞，貼壁生長24h 后，設空白對照組、Celecoxib單藥組（20、40、60、80μmol／L）、聯(lián)合用藥組（80μmol／L Celecoxib 加0.25、0.5、1、2 mg／L OCT）作用12h后，離心收集細胞，加裂解液，4℃下14 000g離心5min，離心收集上清液，BCA 法測蛋白濃度，取每孔30μg 進行SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%用TBST 預混的脫脂奶粉封閉2h，加兔抗人BiP單克隆抗體，及鼠抗人β－actin單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，每次10 min，加入相應二抗室溫孵育2h，TBST 洗滌3次，每次10min，采用化學發(fā)光法（ECL）顯影。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CCK－8檢測細胞增殖能力

結(jié)果顯示藥物作用24h后，聯(lián)合用藥組細胞相對增殖能力較空白對照組和單藥組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。藥物作用48h和72h后，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Celecoxib單藥組及聯(lián)合用藥組細胞基本無存活。與24h 結(jié)果相比，OCT 單藥組隨作用時間增加，細胞受抑制程度反而減輕，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥后，細胞凋亡較Celecoxib單用明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且小劑量的OCT 與Celecoxib聯(lián)合作用，效果更顯著。而OCT 單用細胞凋亡與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 流式細胞儀測定細胞周期

用流式細胞儀分析樣品中各細胞時相的比例發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥與Celecoxib單用相比S期下降（P＜0.05），G0G1期增加（P＜0.05），而G2M 期變化不明顯（P＞0.05）。OCT 單用和Celecoxib單用與空白對照組相比S期下降（P＜0.05），G0G1期增加（P＜0.05），而G2M 期變化不明顯（P ＞0.05），且Celecoxib單用較OCT 單用作用更顯著（P ＜0.05）。見圖3。

圖1 各組細胞相對增殖力Fig.1 Cell relative proliferation in each group

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.2 Analysis of apoptosis by flow cytometry

圖3 流式細胞儀檢測細胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle by flow cytometry

2.4 Western blot檢測BiP蛋白表達

Western blot檢測BiP蛋白表達發(fā)現(xiàn)，隨Celecoxib用量增加，BiP表達量逐漸增加。聯(lián)合用藥后BiP的表達量均較Celecoxib單用減少（圖4）。

圖4 Western blot分析BiP蛋白的表達量Fig.4 Western blot analysis of BiP protein expression

3 討論

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例大約50萬，居西方國家癌癥患者死亡率的第3 位［12］。在亞洲，結(jié)腸癌的患病率正在增加，許多亞洲國家包括中國、日本、韓國、新加坡，在過去的幾十年中結(jié)腸癌的發(fā)生率增加了2～4倍［13］。目前除了早期患者通過手術(shù)治療可以治愈之外，大部分患者就診時已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此術(shù)后通過系統(tǒng)的化療提高生存率尤為重要，但現(xiàn)有的化療方案并不能使已有轉(zhuǎn)移的患者獲得滿意的生存率［12，14］。其重要原因是腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，因此如何減輕腫瘤細胞的耐藥性，探討其耐藥機制，提出新的化療方案，是醫(yī)學工作者共同努力的方向。

OCT 是一種人工合成的長效生長抑素類似物，有著廣泛的作用。它主要通過5種表面受體來傳遞信號，發(fā)揮生物學活性［6］。其直接的抗腫瘤活性主要是通過生長抑素受體2來發(fā)揮作用，而間接的抗腫瘤活性是通過對多種生長激素的分泌抑制來發(fā)揮作用，但其具體的抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡的機制目前仍不太清楚［7－9］。目前研究主要集中于對內(nèi)分泌腫瘤的治療上，如腦垂體瘤引起的肢端肥大癥、腎上腺亢進等［7－9］。另有研究發(fā)現(xiàn)它能促進膽囊癌和胃癌細胞凋亡，并抑制其增殖［10－11］。

近年來流行病學研究表明長期服用NSAIDs可降低癌癥的發(fā)生率和死亡率，同時臨床前和臨床研究也表明一些NSAIDs能作為有效的化療藥物治療腫瘤，特別是消化道腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌和直腸癌等［1－4］。研究報道NSAIDs的抗腫瘤作用主要是通過抑制腫瘤細胞COX 的表達來誘導腫瘤細胞凋亡，然而一系列研究結(jié)果表明NSAIDs誘導細胞凋亡也存在非COX 依賴機制［5，15－17］。和其他化療藥物一樣，腫瘤細胞對NSAIDs的耐藥性也是其治療腫瘤的主要障礙之一。研究表明，用Celecoxib 對消化道腫瘤進行化療時，Celecoxib能誘導腫瘤細胞產(chǎn)生UPR，從而削弱Celecoxib 誘導腫瘤細胞凋亡的作用［5］。

UPR 是由于氧化應激、化學毒性、鈣離子耗竭、缺氧等刺激造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白大量蓄積進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微環(huán)境，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引起一系列信號轉(zhuǎn)導，最終導致一系列基因的轉(zhuǎn)錄活化，產(chǎn)生一系列復雜的生物學效應［18－20］。其最終結(jié)果取決于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的程度，首先通過適應性調(diào)節(jié)和抗凋亡通路使細胞得以生存，當適應性調(diào)節(jié)失敗，不能維持細胞的正常功能時，便通過啟動細胞死亡程序使細胞死亡［18－20］。

BiP也稱GRP78（78－kD glucose－regulated protein），屬于熱休克蛋白HSP70亞家族，它是一種鈣離子結(jié)合分子伴侶，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是UPR激活的標志性分子［21］。當各種應激導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白折疊受到干擾而不能完全正常進行時，BiP的表達量就會被上調(diào)，隨后BiP 會結(jié)合到錯誤折疊的蛋白，以避免這些蛋白形成聚集物，并促進這些蛋白的正確折疊以維持細胞的正常功能［21］。因此BiP對于維持細胞穩(wěn)態(tài)和防止細胞凋亡具有重要作用。

本實驗通過聯(lián)合應用OCT 與Celecoxib 對人結(jié)腸癌細胞SW480進行干預后發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合應用對腫瘤細胞的增殖抑制作用強于兩者單獨應用。Celecoxib單用強于OCT 單用，并隨作用時間延長效果加強。而OCT 的作用隨時間延長效果反而相對減弱，說明OCT 的短期應用效果顯著，長期作用似乎因耐受而減弱。這與Wang等［10］的研究有些不一致。通過對凋亡率的檢測發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥使得腫瘤細胞的凋亡率增加，而單用OCT 并不能增加腫瘤細胞的凋亡率，反而有輕微的下降，但差異并不具有統(tǒng)計學意義。同時發(fā)現(xiàn)Celecoxib與小劑量的OCT 聯(lián)合應用后細胞凋亡率的增加更加明顯。通過以上研究結(jié)果可知，兩藥聯(lián)合應用確實能有效增強Celecoxib的抗腫瘤效果。通過對UPR 的標志分子BiP的研究發(fā)現(xiàn)，Celecoxib作用于腫瘤細胞后能使BiP的表達量增加，這與Tsutsumi等［5］的研究結(jié)果一致。聯(lián)合應用OCT 后，BiP 的表達量下降，這與凋亡率增加的結(jié)果相反，證明OCT 能抑制UPR 的發(fā)生，進而減輕腫瘤細胞的耐藥性，增強腫瘤細胞對Celecoxib的敏感性。但OCT 對Celecoxib的正協(xié)同作用是否直接依賴于對UPR 的抑制還需進一步的研究。

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