腎上腺髓質(zhì)素對(duì)鼠成骨細(xì)胞IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR mRNA 表達(dá)的影響

尹德龍， 田林強(qiáng)， 葉 媛， 程 鵬， 李昆朋，宮 晨， 林 陽， 郭風(fēng)勁， 陳安民△

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢 430030

2 武漢市普愛醫(yī)院ICU，武漢 430070

骨形成是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，此過程涉及多種細(xì)胞，并受各種細(xì)胞因子的調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn)的一種生物活性多肽——腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM），是成骨細(xì)胞增殖分化的強(qiáng)激活劑，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的防治，可能具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1－2］。已有研究表明，將無血管活性的ADM 肽段注入成年小鼠皮下，其成骨指數(shù)明顯升高［3］。為進(jìn)一步研究其促進(jìn)成骨的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要觀察ADM 對(duì)鼠成骨細(xì)胞胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）及胰島素樣生長因子Ⅰ型受體（IGF－ⅠR）mRNA 表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新生0～3dSD 大鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供）；低糖DMEM 培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；ADM（美國Phoenix Pharmaceutics Inc）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司）；青霉素、鏈霉素雙抗（武漢博士德公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMix DNA 聚合酶（日本TOYOBO 公司）；PCR 引物（由上海英駿公司合成）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將ADM 配制成10－13～10－11mol／L 的終濃度［2］，分別對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞作用12h 和24h。分組如下：A 組（對(duì)照組，不加ADM），B 組（10－13mol／L ADM，作用12h），C組（10－12mol／L ADM，作用12 h），D 組（10－11mol／L ADM，作用12 h），E 組（10－11mol／L ADM，作用24h）。

1.3 新生SD大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)

在無菌操作下完整取出乳鼠（新生0～3dSD大鼠）顱蓋骨，加入0.1% Ⅰ型膠原酶室溫靜置30 min后，于37℃條件下剪碎振蕩消化20min。1 000 r／min離心10min后，將細(xì)胞沉淀用少量含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（含雙抗?jié)舛葹?00 U／mL）重懸，以1×105個(gè)／mL 接種于25cm 培養(yǎng)瓶，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h后換液1次，以后每3天換液1次。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用第2代成骨細(xì)胞，培養(yǎng)條件同上。待細(xì)胞充分貼壁并達(dá)80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并接種于6孔板中，換用含0.1%牛血清白蛋白的無血清低糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后按上述實(shí)驗(yàn)分組，改用含藥物（AMD）培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間分別為12h和24h。

1.4 采用RT－PCR的方法進(jìn)行目的基因表達(dá)的檢測

1.4.1 總RNA 提取及檢測 采用Trizol試劑盒提取總RNA，并用無RNA 酶水溶解，標(biāo)本稀釋后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度，另取標(biāo)本做快速瓊脂糖凝膠電泳，以分析RNA 的完整性。根據(jù)測定值調(diào)整RNA 標(biāo)本濃度為1μg／μL。

1.4.2 RT－PCR 方法檢測IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR mRNA 的表達(dá) 取2μL RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列如下：IGF－Ⅰ，上游引物5′－CACACCCAGGAGGGGAACAG－3′，下游引物 5′－GTGTTGTTGATGCTCCGTCC－3′；IGF－ⅠR，上游引物5′－TCCACATCCTGCTCATCTCC－3′，下游引物5′－TGCCTTCCCACACACACTTG－3′。于PCR 儀根據(jù)不同的產(chǎn)物類型及大小設(shè)置變性、退火、延伸溫度及時(shí)間，循環(huán)次數(shù)。反應(yīng)條件：IGF－Ⅰ為94℃變性60s、55℃退火45s、72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)。IGF－ⅠR 為94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；所有循環(huán)最后均72℃延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)JS－380自動(dòng)凝膠圖像分析儀照相；計(jì)算目的條帶的灰度值與對(duì)應(yīng)內(nèi)參β－actin的灰度值之比，用BandScan軟件進(jìn)行圖像分析處理，以此半定量目的基因表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠成骨細(xì)胞

所取培養(yǎng)3d的原代SD 大鼠成骨細(xì)胞，如圖1所示細(xì)胞體積較大，呈鱗片狀，胞質(zhì)豐富，有偽足。

圖1 培養(yǎng)3d的成骨細(xì)胞原代細(xì)胞（×100）Fig.1 SD rat osteoblast after 3－day culture（×100）

2.2 IGF－Ⅰ、IGF－ⅠR 的擴(kuò)增產(chǎn)物

IGF－Ⅰ、IGF－ⅠR 的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為321bp和490bp，電泳圖見圖2。

圖2 各組IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR 擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of IGF－Ⅰand IGF－ⅠR

2.3 ADM 對(duì)IGF－ⅠmRNA表達(dá)的影響

ADM 能夠刺激IGF－ⅠmRNA 的表達(dá)，而且這種刺激作用與藥物濃度和作用時(shí)間有關(guān)。在作用12h后，10－11mol／L 的ADM（D 組）可以明顯促進(jìn)IGF－ⅠmRNA 表達(dá)（與A 組相比，P＜0.05）；作用24h（E 組）后IGF－ⅠmRNA 表達(dá)即下降（與A 組相比P＞0.05）（圖3）。

圖3 ADM 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞IGF－ⅠmRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of ADM on IGF－ⅠmRNA expression of rat osteoblasts

2.4 ADM 對(duì)IGF－ⅠR mRNA的影響

ADM 可以上調(diào)IGF－ⅠR mRNA 表達(dá)，呈劑量依賴性（圖4），作用12h后D 組的IGF－ⅠR mRNA表達(dá)較A 組明顯增高（P ＜0.05），10－11mol／L ADM 在作用24h后（E 組）IGF－ⅠR mRNA 仍高表達(dá)（與A 組相比，P ＜0.05），證明ADM 對(duì)IGF－ⅠR mRNA高表達(dá)作用時(shí)間較對(duì)IGF－Ⅰ更長。

圖4 ADM 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞IGF－ⅠR mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of ADM on IGF－ⅠR mRNA expression of rat osteoblasts

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，ADM（濃度為10－13～10－11mol／L）可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR 基因mRNA 的表達(dá)，并呈藥物濃度和時(shí)間依賴性，ADM 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖可能通過此信號(hào)通路發(fā)揮其作用。

Cornish等［2］發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，ADM濃度在10－13～10－11mol／L時(shí)能有效刺激大鼠成骨細(xì)胞增殖，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將ADM 注入成年小鼠的顱骨中，連續(xù)注射5d，2周后對(duì)其骨形成及吸收指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示顱骨成骨活性提高了2～4倍，且成骨作用有劑量依賴性，表明ADM 在體內(nèi)及體外均可促進(jìn)骨形成。為了進(jìn)一步研究ADM 促進(jìn)骨形成的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠原代成骨細(xì)胞，觀察不同濃度的ADM 對(duì)成骨細(xì)胞的IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR基因表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ADM 能夠刺激IGF－ⅠmRNA 表達(dá)，而且這種刺激作用與藥物濃度和作用時(shí)間有關(guān)。ADM 可以明顯促進(jìn)IGF－ⅠmRNA 表達(dá)，以10－11mol／L的濃度作用12h最為顯著，本實(shí)驗(yàn)同樣亦發(fā)現(xiàn)，ADM 同時(shí)可以上調(diào)IGF－ⅠR mRNA表達(dá)，呈劑量依賴性。有研究表明ADM 能夠刺激成骨細(xì)胞增殖，使成骨細(xì)胞cAMP 含量和PKA、PKC、MAPK 活性增加，激活PKC 和MAPK／ERK是其主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而IGF－Ⅰ的產(chǎn)生可以由cAMP 介導(dǎo)的基因表達(dá)所誘導(dǎo)［4］，因而ADM 可能通過此通路調(diào)節(jié)IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR mRNA 表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，ADM 作用24h后，IGF－ⅠmRNA 表達(dá)下降，與對(duì)照組無明顯差異，而IGF－ⅠR mRNA卻一直保持較高的表達(dá)，可能表明ADM 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖更主要是通過刺激IGF－ⅠR 蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)IGF－Ⅰ的自分泌或旁分泌作用發(fā)揮其促骨形成效應(yīng)。

ADM 是Kitamura等［5］于1993年從人嗜鉻細(xì)胞瘤中分離出的一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的肽類物質(zhì)。屬于降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）家族，該家族包括降鈣素、CGRP、Amylin和ADM，CGRP家族的成員對(duì)骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用［2，6］。ADM 廣泛分布于心血管系統(tǒng)以及腎、腦、肺等多種組織器官，同時(shí)在骨組織也呈高表達(dá)［5］，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)促進(jìn)骨生成［7］。IGF－Ⅰ是一種多功能的細(xì)胞生長增殖調(diào)控因子，與骨骼中受體結(jié)合發(fā)生受體自身磷酸化后激活酪氨酸蛋白酶，促使胰島素受體底物磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和代謝［8］。在體外可刺激成骨細(xì)胞DNA 和蛋白質(zhì)合成，體內(nèi)能夠促進(jìn)骨及軟骨生長，其對(duì)參與骨轉(zhuǎn)換的所有細(xì)胞均具有刺激有絲分裂和啟動(dòng)分化的活性，尤其增加成骨細(xì)胞數(shù)目和功能［9］。

有研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松和骨量減少患者血漿中ADM 含量顯著高于正常骨密度人群。在腰椎和髓部，隨骨密度降低，血漿ADM 含量增高，ADM 含量增高可能是機(jī)體為對(duì)抗骨量丟失而代償?shù)慕Y(jié)果［10］。IGF－Ⅰ水平下降是骨質(zhì)疏松重要的發(fā)病機(jī)制之一，老年人血清中IGF－Ⅰ水平降低是引發(fā)骨質(zhì)疏松和骨折的重要原因［11］。以上研究提示我們，ADM 有可能作為一種新的治療手段在促進(jìn)骨愈合以及防治骨質(zhì)疏松上發(fā)揮一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)為ADM 用于臨床治療骨質(zhì)疏松或骨折提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

ADM 有廣泛生物學(xué)效應(yīng)，近期研究顯示，ADM促成骨細(xì)胞增殖與血管舒張作用的活性區(qū)是不同的。在ADM 肽鏈中有特定的促成骨細(xì)胞增殖區(qū)，此區(qū)存在于ADM 梭基端，這就為ADM 肽段作為治療用藥提供了理論依據(jù)。綜上所述，ADM 肽段具有的成骨活性為其用于骨質(zhì)疏松的治療提供了廣闊的前景［12］。但是，ADM 能否用于骨質(zhì)疏松和骨量減少性疾病的治療，還需對(duì)其影響成骨調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行觀察，以及通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值，這些都有待深入研究。

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