被動(dòng)吸煙誘導(dǎo)的胎兒生長(zhǎng)受限大鼠胎盤(pán)血管結(jié)構(gòu)異常及其機(jī)制＊

陳鎮(zhèn)燕， 李 靜， 黃光英

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030

胎盤(pán)作為母胎之間的血液交換器官，它的結(jié)構(gòu)與功能直接影響到胎兒的宮內(nèi)發(fā)育，母胎間的營(yíng)養(yǎng)交換是通過(guò)胎盤(pán)絨毛母血間隙與絨毛內(nèi)胎兒血管間血液交換進(jìn)行的。胎兒生長(zhǎng)受限（fetal growth retardation，F(xiàn)GR）的發(fā)生與胎盤(pán)血管減少及胎盤(pán)功能不足有關(guān)［1］。調(diào)節(jié)血管的因子主要為：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體VEGFR1、VEGFR2 即VEGF／VEGFR 系統(tǒng)；Angpt1、Angpt2及其共同受體Tie2即Angpt／Tie2系統(tǒng)［2］。VEGF－A 及其受體結(jié)合可刺激原始祖細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、遷移組建成內(nèi)皮細(xì)胞管。Tie2與Angpt1結(jié)合可促進(jìn)血管周細(xì)胞聚集、包繞血管內(nèi)皮細(xì)胞管，維持血管的穩(wěn)定。而Angpt2是Angpt1的拮抗因子，Tie2與Angpt2結(jié)合則減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管周細(xì)胞的連接，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF等生長(zhǎng)因子更加敏感，增殖能力越強(qiáng)，從而使血管處于一種可塑造狀態(tài)，促進(jìn)血管的重組［3］。

目前關(guān)于胎盤(pán)血管調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因鼠類(lèi)與人類(lèi)的胎盤(pán)相似，故通常用鼠類(lèi)作研究模型。鼠類(lèi)胎盤(pán)由外到內(nèi)依次為：基底層、海綿層（spongiotrophoblast，Sp）、迷路層（labyrinth，La）?；讓邮翘ケP(pán)邊緣殘留的母體子宮肌層組織，海綿層及迷路層是胎盤(pán)的功能層，其中迷路層為胎盤(pán)的血管交換層。由于迷路層內(nèi)無(wú)母體的內(nèi)皮細(xì)胞，母血由滋養(yǎng)細(xì)胞圍繞，形成所謂的母體血竇［4］，而絨毛內(nèi)的胎兒血管有內(nèi)皮細(xì)胞包繞，因此本研究通過(guò)BS－lectin來(lái)標(biāo)記絨毛內(nèi)胎兒血管內(nèi)皮細(xì)胞［5］以研究被動(dòng)吸煙所誘導(dǎo)的FGR 胎盤(pán)絨毛血管形態(tài)學(xué)的異常，闡明FGR 胎盤(pán)血管異常及其機(jī)制，以期為尋找更好的FGR 治療方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與標(biāo)本制備

健康無(wú)交配史的SPF級(jí)SD 大鼠購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部（質(zhì)量許可證號(hào)SCXK 2004－0007），按雌雄分籠飼養(yǎng)。每晚將雌鼠和雄鼠合籠（雌雄比為2∶1），次日分籠，觀察陰道涂片，如發(fā)現(xiàn)精蟲(chóng)，記為妊娠第1天。將已受精雌鼠12只，隨機(jī)分為正常組和FGR 組。FGR 組大鼠于妊娠第7天起，置于煙霧吸入箱中，每次燃煙4 支（湖北武漢卷煙廠制，煙堿含量1.5mg，CO 含量13 mg），吸煙箱留有通氣縫，每次燃煙后不揭蓋直至下次熏煙。2次間隔時(shí)間為2h，每天熏煙4次。妊娠第21天時(shí)，戊巴比妥鈉麻醉（麻醉用量為50 mg／kg）后剖腹取胎鼠及胎盤(pán)并稱(chēng)重，每只孕鼠取3 個(gè)胎盤(pán)（1個(gè)位于子宮中央，另外2個(gè)分別位于兩邊）。從臍帶中央位點(diǎn)將每個(gè)胎盤(pán)垂直切成兩半，將一半胎盤(pán)浸于10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，另一半再?gòu)哪殠е醒胛稽c(diǎn)處均分成兩半即1／4 胎盤(pán)，分別用錫箔紙包裹置于－80℃保存以備熒光PCR 檢測(cè)及Western blot檢測(cè)。

1.2 胎盤(pán)血管密度的檢測(cè)

BS－lectin為血管凝集素，可凝集紅細(xì)胞并特異性與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此可用于胎盤(pán)血管染色分析［5］。切片常規(guī)脫蠟后置于0.01mol／L PBST（0.01 mol／L 磷酸鹽緩沖液含1‰ 吐溫20，pH＝7.4）洗3 次共15 min，3%的H2O237℃封閉內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶10min（避光），PBST 洗15min，0.1%胰酶（谷歌生物科技公司，含1 mmol／L 的CaCl2及MgCl2）37℃消化10 min，PBST 洗15min，1%的牛血清白蛋白（BSA，谷歌生物科技公司）封閉10min，親和素－生物素封劑（Vector公司，USA）依次分別封閉15 min，PBST 洗15 min，TBS（Tris－base 60.57 g，NaCl 87.00 g，用H2O 加至1000mL，其中CaCl2及MgCl2各含1.0 mmol／L）孵育10min，PBST 洗10min，100μg／mL的生物素標(biāo)記的BS－lectin（Sigma，USA）孵育20 min以標(biāo)記血管，PBST 洗15min，鏈霉親和素結(jié)合的辣根過(guò)氧化氫酶（北京博奧森生物科技有限公司）孵育30 min，PBST 洗15 min，DAB（Dako 公司，Denmark）顯色后，蘇木精復(fù)染，氨水返藍(lán)后常規(guī)脫水，中性樹(shù)脂封片。

1.3 體視學(xué)方法分析胎盤(pán)血管

胎盤(pán)血管用BS－lectin 染色后，組織切片用Canon 影像系統(tǒng)拍照（Canon，Japan，350D）。所有切片的測(cè)量由同一個(gè)人完成，且未告知其組織切片的分組。采用IPP 6.0 軟件分析，運(yùn)用數(shù)點(diǎn)方法計(jì)算大鼠胎盤(pán)血管密度。首先分析胎盤(pán)各組成部分所占胎盤(pán)的總體積百分比，放大倍數(shù)為4，系統(tǒng)選擇胎盤(pán)切片不重復(fù)部位視野并拍照，同時(shí)涵蓋切片的各部位。運(yùn)行IPP 6.0的網(wǎng)格程序后選擇111點(diǎn)網(wǎng)格即111個(gè)點(diǎn)均勻覆蓋顯微鏡下拍攝的視野相片，分別數(shù)落在迷路層的點(diǎn)數(shù)及胎盤(pán)組織的總點(diǎn)數(shù)，兩者間的比值即為胎盤(pán)迷路層的體積百分比。然后在40倍顯微鏡下進(jìn)一步分析迷路層內(nèi)胎兒血管的體積密度，數(shù)落在胎兒血管的點(diǎn)數(shù)及迷路層的點(diǎn)數(shù)從而計(jì)算迷路層的胎兒血管體積密度。胎盤(pán)血管體積密度即為胎盤(pán)迷路層體積百分比與迷路層胎兒血管體積密度的乘積。假設(shè)胎盤(pán)的密度為1g／cm3，依據(jù)其質(zhì)量估算胎盤(pán)的總體積，通過(guò)胎盤(pán)總體積與體積分?jǐn)?shù)的乘積計(jì)算胎盤(pán)各成分的體積［6］。用1mm的標(biāo)尺在不同倍數(shù)顯微鏡下拍照后導(dǎo)入IPP軟件，測(cè)量血液交換屏障的厚度。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)胎盤(pán)組織的VEGF－A、VEGFR1、VEGFR2、Tie2、Angpt1、Angpt2的mRNA表達(dá)

Trizol試劑盒（TaKaRa公司）提取胎盤(pán)RNA，取1μg的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2μL 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，0.4μL 正向引物（10μmol／L），0.4μL 反向引物（10μmol／L），0.4μL的passive reference dye，7.8μL ddH2O及10μL 2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司）混合，進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。ABI StepOne Real－Time PCR System（Applied Biosystems公司，USA）檢測(cè)基因的表達(dá)量。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成（引物序列見(jiàn)表1）?；驍U(kuò)增條件均為95℃30s，95℃5s，60℃30s，擴(kuò)增完后依據(jù)目的基因與內(nèi)參基因β－actin的CT 值差值即ΔCT 確定目的基因表達(dá)。將一個(gè)樣本的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋2 倍、4 倍、8 倍、16 倍，檢測(cè)5種稀釋倍數(shù)下熒光PCR 擴(kuò)增的CT 值，將標(biāo)準(zhǔn)品1倍的CT 設(shè)為參照，計(jì)算其它稀釋倍數(shù)的CT與參照CT 的差值即ΔCT，標(biāo)準(zhǔn)品1倍的基因表達(dá)量為20＝1，其它稀釋倍數(shù)的基因表達(dá)量即為2－ΔCT，計(jì)算基因稀釋倍數(shù)與基因表達(dá)量間的相關(guān)系數(shù)r2即可得到基因的擴(kuò)增效率，經(jīng)檢測(cè)各引物擴(kuò)增效率接近100%。將正常組一個(gè)胎盤(pán)的VEGF－A的表達(dá)量設(shè)為1，其它的表達(dá)量均以此為參照，計(jì)算公式為2－ΔΔCT。

表1 基因引物序列Table 1 Primers used for real－time PCR

1.5 免疫組化法檢測(cè)胎盤(pán)組織的VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白的表達(dá)

VEGF－A、VEGFR2（Thermo 公司，USA）、Tie2（Santa Cruz公司，USA）、Angpt2（Abcham 公司，USA）均為兔抗大鼠多克隆抗體，抗體稀釋濃度分別為1∶300、1∶50、1∶50、1∶100。切片常規(guī)脫水后，微波90～100℃抗原修復(fù)10min，VEGF－A 修復(fù)液為1mmol／L EDTA，pH＝8.0，其它抗體修復(fù)液均為枸櫞酸鹽，pH＝6.0，PBST 洗3 次，共15 min，3%的H2O237℃封閉內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶10 min（避光），PBST 洗15min，一抗4℃孵育過(guò)夜（一抗用一抗稀釋液稀釋?zhuān)♂屢汉?%BSA）。次日，室溫復(fù)溫30min，PBST 洗15min，二抗（中杉金橋兔二步法非生物素檢測(cè)試劑盒）37℃孵育1h，PBST 洗15min，DAB顯色后，蘇木精復(fù)染，氨水返藍(lán)后常規(guī)脫水，中性樹(shù)脂封片。依據(jù)抗體表達(dá)部位特點(diǎn)來(lái)判斷免疫組化切片的可靠性，如VEGF－A 主要表達(dá)于海綿滋養(yǎng)層及迷路滋養(yǎng)層，胎盤(pán)邊緣的基底層子宮肌層細(xì)胞陰性，則將肌層為陰性的免疫組化切片納入VEGF－A 蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析；VEGFR2、Tie2、Angpt2均表達(dá)于迷路層，海綿滋養(yǎng)層不表達(dá)，則將海綿滋養(yǎng)層陰性切片納入VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析。免疫組化陽(yáng)性表達(dá)采用半定量方法：“－”表示不著色，陰性表達(dá)；“＋”表示弱表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)可檢測(cè)到；“?”表示中度表達(dá)，著色明顯；“?”表示強(qiáng)表達(dá)；“”表示極強(qiáng)表達(dá)，非表達(dá)部位也強(qiáng)陽(yáng)性著色。

1.6 Western blot法檢測(cè)胎盤(pán)組織的VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白的表達(dá)

將胎盤(pán)于10倍體積組織蛋白裂解液中勻漿，勻漿后用BAC蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)濃度，將100μg蛋白與上樣緩沖液混合后，高溫變性10min，于SDSPAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移酸纖維素膜；膜用含有5%的脫脂奶粉的PBST 閉封1h后，PBST 洗3次，加入一抗4℃過(guò)夜（VEGF－A 1∶200，VEGFR2 1∶100，Angpt2 1∶200，Tie2 1∶100），洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃溫育，化學(xué)發(fā)光法定影顯影，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的分子量和吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的則用±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與FGR 組胎鼠體重、胎盤(pán)重量的比較

正常組（n＝73）胎鼠體重、胎盤(pán)重量分別為（4.101±0.418）g，（0.702±0.253）g；FGR 組（n＝70）胎鼠體重、胎盤(pán)重量分別為（3.690±0.354）g，（0.595±0.103）g，n＝70。與正常組相比，F(xiàn)GR 組胎鼠體重、胎盤(pán)重量明顯減輕（均P＜0.01）。

2.2 正常組與FGR 組胎盤(pán)形狀及胎盤(pán)血管形態(tài)學(xué)的比較

和正常組胎盤(pán)相比，F(xiàn)GR 組胎盤(pán)較為扁平，迷路層滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)性狀不規(guī)則，其所含嗜堿性染色質(zhì)增多，某些細(xì)胞胞核與胞質(zhì)邊界不清；血液交換屏障由于嗜堿性物質(zhì)沉積而厚度顯著增加（P＜0.05），迷路層、海綿層總體積及胎盤(pán)胎兒血管總體積均顯著減少（均P＜0.05）。與正常胎盤(pán)相比，F(xiàn)GR 組胎盤(pán)血管密度超出正常組范圍上下限，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2，圖1、圖2。

2.3 各組胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR1、VEGFR2、Tie2、Angpt1、Angpt2mRNA的表達(dá)

妊娠第21天胎盤(pán)VEGF－A mRNA 豐度最高，約為VEGFR1的3倍，VEGFR2的500倍，Tie2的20倍，Angpt1的50倍，Angpt2的100倍。和正常組相比，F(xiàn)GR 組的VEGF－A mRNA、VEGF－A mRNA 與VEGFR1 mRNA 的比值顯著降低（均P＜0.05）。VEGFR1、VEGFR2、Tie2、Angpt1、Angpt2均在FGR 組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表2 胎盤(pán)血管形態(tài)學(xué)的比較［n＝18，±s，（min～max）］Table 2 Comparison of placental morphological parameters［n＝18，±s，（min－max）］

表2 胎盤(pán)血管形態(tài)學(xué)的比較［n＝18，±s，（min～max）］Table 2 Comparison of placental morphological parameters［n＝18，±s，（min－max）］

＊P＜0.05 vs.normal group

Morphological parameters Normal groupFGR group Proportion of spongiotrophoblast 0.209±0.066（0.140－0.300）0.201±0.042（0.110－0.240）Proportion of labyrinth 0.789±0.065（0.700－0.860）0.798±0.004（0.760－0.890）Total volume of labyrinth（mm3）611±133（479－838）438±72＊（280－511）Total volume of spongiotrophoblast（mm3）241±167（110－569）113±38＊（56－158）Fetal capillaries volume density in labyrinth 0.113±0.018（0.086－0.135）0.100±0.450（0.032－0.158）Total volume of fetal capillaries（mm3）70±19（49－94）45±21＊（13－81）Exchange barrier（μm）1.967±0.543（1.157－2.284）5.839±0.205＊（5.623－6.031）

圖1 BS－lectin組織化學(xué)染色顯示大鼠胎盤(pán)迷路層胎兒血管（DAB顯色，×40）Fig.1 Histochemical analysis with BS－lectin to identify fetal capillaries in the placental labyrinth（DAB，×40）

2.4 各組胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白的表達(dá)

圖2 BS－lectin組織化學(xué)染色顯示大鼠胎盤(pán)母胎血液交換屏障（DAB顯色，×100）Fig.2 Histochemical analysis with BS－lectin to identify the exchange barrier between fetal circulation and mother circulation（DAB，×100）

表3 胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR1、VEGFR2、Tie2、Angpt1、Angpt2mRNA 的表達(dá)（n＝18，±s）Table 3 Placental VEGF－A，VEGFR1，VEGFR2，Tie2，Angpt1and Angpt2mRNA expression（n＝18，±s）

表3 胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR1、VEGFR2、Tie2、Angpt1、Angpt2mRNA 的表達(dá)（n＝18，±s）Table 3 Placental VEGF－A，VEGFR1，VEGFR2，Tie2，Angpt1and Angpt2mRNA expression（n＝18，±s）

＊P＜0.05 vs.normal group

Genes Normal group FGR group VEGF－A 1.52±0.59 1.06±0.48＊VEGFR1 0.39±0.15 0.46±0.22 VEGF－A／VEGFR1 3.96±1.16 2.56±1.17＊VEGFR2 0.003 3±0.004 2 0.004 3±0.006 7 Angpt1 0.032±0.029 0.046±0.035 Angpt2 0.017±0.013 0.028±0.019 Tie2 0.070±0.084 0.095±0.091

妊娠第21天胎盤(pán)VEGF－A 蛋白表達(dá)豐富，強(qiáng)表達(dá)于海綿層滋養(yǎng)細(xì)胞，其次為迷路層滋養(yǎng)細(xì)胞，胎兒血管內(nèi)皮細(xì)胞可有表達(dá)，絨毛內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞有少量表達(dá)，海綿層糖原細(xì)胞及胎盤(pán)基底層幾乎不表達(dá)。VEGFR2主要表達(dá)于迷路層滋養(yǎng)細(xì)胞，胎兒血管內(nèi)皮細(xì)胞可有表達(dá)，絨毛內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞及海綿層滋養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)。Tie2 的表達(dá)空間分布與VEGFR2類(lèi)似。Angpt2主要表達(dá)于迷路層微絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，胎兒血管內(nèi)皮細(xì)胞可有表達(dá)，絨毛內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞及海綿層滋養(yǎng)細(xì)胞均不表達(dá)。正常組有3個(gè)胎盤(pán)的VEGF－A 蛋白為極強(qiáng)表達(dá)（），F(xiàn)GR 組有6個(gè)樣本為極強(qiáng)表達(dá)（），其余的樣本表達(dá)強(qiáng)度介于弱陽(yáng)性（＋）至強(qiáng)陽(yáng)性（?）。VEGFR2蛋白在FGR組有2個(gè)樣本為中等陽(yáng)性（?），F(xiàn)GR 組的其他樣本及正常組樣本均為弱陽(yáng)性（＋）。Angpt2蛋白在正常組與FGR 組各有6個(gè)樣本為陰性（－），4個(gè)FGR組胎盤(pán)為強(qiáng)陽(yáng)性（?）外，其余介于弱陽(yáng)性（＋）至中等陽(yáng)性（?）間。Tie2 蛋白表達(dá)兩組均介于陰性（－）及弱陽(yáng)性（＋）表達(dá)間。與免疫組化分析結(jié)果一致，Western blot蛋白檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)兩組間血管因子的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3、4，表4）。

3 討論

FGR 是常見(jiàn)的產(chǎn)科并發(fā)癥，不僅是圍生期胎兒發(fā)病和死亡的主要原因，而且與成人的心血管、內(nèi)分泌及生殖等系統(tǒng)疾病發(fā)病相關(guān)，目前尚無(wú)針對(duì)FGR的特效治療［7］。由于胎盤(pán)內(nèi)母血間隙與絨毛內(nèi)胎兒血管間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換是胎兒氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給的關(guān)鍵，因此關(guān)于胎盤(pán)血管系統(tǒng)生成的分子機(jī)制及病理妊娠的胎盤(pán)血管改變已開(kāi)展了大量的研究，寄以尋求一種能改善胎盤(pán)血管交換功能的特效方法從而促進(jìn)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育。

圖3 免疫組化染色示胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白的表達(dá)（DAB顯色，×40）Fig.3 Placental VEGF－A，VEGFR2，Tie2and Angpt2mRNA expression detected by using immunohistochemistry（DAB，×40）

圖4 Western blot檢測(cè)胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2蛋白的表達(dá)Fig.4 Placental VEGF－A，VEGFR2，Tie2and Angpt2protein expression detected by using Western blot

表4 Western blot法比較胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2 蛋白的表達(dá)（n＝10，±s）Table 4 Comparison of placental VEGF－A，VEGFR2，Tie2and Angpt2protein expression by Western blot（n＝10，±s）

表4 Western blot法比較胎盤(pán)VEGF－A、VEGFR2、Tie2、Angpt2 蛋白的表達(dá)（n＝10，±s）Table 4 Comparison of placental VEGF－A，VEGFR2，Tie2and Angpt2protein expression by Western blot（n＝10，±s）

Proteins Normal group FGR group P value VEGF－A／actin 1.341±0.391 1.728±0.715 0.186 VEGFR2／actin 0.330±0.087 0.371±0.108 0.665 Tie2／actin 1.286±0.385 1.356±0.534 0.443 Angpt2／actin 0.347±0.116 0.397±0.262 0.803

胎盤(pán)絨毛血管形成分子機(jī)制復(fù)雜，受很多因子調(diào)控，是隨時(shí)空變化的復(fù)雜三維動(dòng)態(tài)過(guò)程［8］。不同病理?xiàng)l件下，胎盤(pán)血管的改變不一致。高原妊娠、妊娠貧血（母血氧含量減少）及妊高癥（母血氧含量正常但滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足以致子宮動(dòng)脈改造不足［9］）均可致胎盤(pán)絨毛間隙氧分壓降低，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）蛋白表達(dá)增加［10］，HIF 蛋白在正常氧環(huán)境下被蛋白酶快速水解，而缺氧時(shí)，HIF 蛋白穩(wěn)定，與特定DNA 序列結(jié)合后可激活VEGF－A 等多種基因的轉(zhuǎn)錄以刺激血管的生成［10］。許多研究已證實(shí)高原妊娠［11］、妊高癥［12］等胎盤(pán)血管總體積減少，但其血管密度代償性增加，其血管生長(zhǎng)因子VEGF－A 表達(dá)升高；重癥FGR 胎兒（即舒張末期臍血流消失型FGR 胎兒）由于胎兒生長(zhǎng)嚴(yán)重受限，胎兒從絨毛間隙中攝氧量劇減以致胎盤(pán)絨毛間隙氧分壓增加，HIF蛋白不穩(wěn)定，VEGF－A 等血管因子表達(dá)降低，胎盤(pán)血管密度顯著降低。

吸煙孕婦母血中CO 含量增加而O2減少，可導(dǎo)致胎盤(pán)絨毛間隙氧分壓降低，由此推測(cè)吸煙孕婦的胎盤(pán)血管密度應(yīng)代償性增多。然而研究結(jié)果存在許多分歧，Larsen 等［13］在2002 年及Bush 等［14］在2000年運(yùn)用體視學(xué)分析吸煙孕婦晚期胎盤(pán)的形態(tài)學(xué)改變，證實(shí)FGR 的絨毛血管密度較非吸煙孕婦胎盤(pán)顯著減低，而Pfarrer等［15］在1999年運(yùn)用掃描電鏡觀察比較4名吸煙孕婦晚期胎盤(pán)與4名不吸煙正常孕婦晚期胎盤(pán)的絨毛血管，發(fā)現(xiàn)吸煙孕婦胎盤(pán)血管顯著增生。Michaud等［16］發(fā)現(xiàn)缺氧時(shí)，煙草提取物可通過(guò)抑制HIF 蛋白的表達(dá)來(lái)抑制缺氧狀態(tài)下的血管代償性增生，當(dāng)導(dǎo)入高表達(dá)HIF 基因病毒載體時(shí)可逆轉(zhuǎn)煙草在缺氧條件時(shí)抑制血管增生作用。缺氧可刺激胎盤(pán)血管密度代償增生，煙草又可抑制缺氧所誘發(fā)的血管代償增生反應(yīng)，研究結(jié)果的分歧，可能與這兩種相反作用機(jī)制及孕鼠胎盤(pán)血管代償能力的個(gè)體差異有關(guān)。

本研究中，F(xiàn)GR 胎盤(pán)較正常胎盤(pán)扁平，這可能是種代償反應(yīng)，胎盤(pán)母體面的擴(kuò)張可增加胎盤(pán)著床處的子宮內(nèi)膜面積，從而增加胎盤(pán)著床處血管的數(shù)量以增加胎盤(pán)血供。體外研究表明煙草可損傷早期胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足［17］，胎盤(pán)母體面的擴(kuò)張可代償因滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲深度不足所致的血供不足。FGR 胎盤(pán)厚度變薄可降低胎盤(pán)自身代謝需求，有研究發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)厚度異常增加，將導(dǎo)致絨毛間隙血流灌注阻力增加，絨毛血管樹(shù)枝過(guò)于茂密或復(fù)雜將導(dǎo)致胎盤(pán)灌注不足［18］。本研究FGR 組的胎盤(pán)總血管體積較正常組顯著減少，而母血交換屏障顯著增厚提示FGR 胎盤(pán)血液交換功能下降，F(xiàn)GR 組血管密度范圍超出正常組的上限及下限，這提示FGR 胎盤(pán)血管結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但其改變存在不一致性，一部分FGR 胎兒血管密度增加，這可能是缺氧條件下胎盤(pán)血管密度代償增生所致，一部分FGR 胎兒血管密度減少，可能是在煙草刺激下，孕鼠個(gè)體代償能力低，胎鼠生長(zhǎng)嚴(yán)重受限，胎兒從絨毛間隙中攝氧量劇減以致血管密度減少。

總之，本研究并未證實(shí)當(dāng)初假設(shè)即吸煙通過(guò)降低血管因子的表達(dá)從而減少胎盤(pán)血管密度。FGR胎盤(pán)的血管總體積顯著低于正常胎盤(pán)，母血交換屏障顯著增厚提示FGR 胎盤(pán)血液交換下降，從而限制胎兒的發(fā)育，然而胎盤(pán)血管密度及血管因子的表達(dá)并未減少，反而有增高趨勢(shì)，所以導(dǎo)入外源性血管因子并無(wú)治療FGR 胎兒的功效，反而促使小鼠胎盤(pán)迷路層纖維存積、胚胎重量減輕及吸收胚胎增加［19］，吸煙所導(dǎo)致的FGR 胎盤(pán)血管異常的分子機(jī)制仍待今后深入研究。

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