腺苷對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用＊

李 巷， 康慧聰， 劉曉艷， 胡 琦， 許 峰， 劉志廣， 朱遂強(qiáng)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430030

近年來，腺苷（adenosine）作為內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑受到關(guān)注。研究表明，腺苷不僅有廣泛的腦保護(hù)作用［1］，且對正常中樞神經(jīng)元和癇樣放電的神經(jīng)細(xì)胞都有抑制作用［2－3］。腺苷的抑制作用主要表現(xiàn)在影響癲癇發(fā)作后不應(yīng)期，使放電閾值增高；Acsar等［4］報(bào)道其主要是作用于突觸后膜，增大K＋電導(dǎo)引起膜超極化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞膜上有多種鉀通道，大電導(dǎo)鈣激活性鉀通道（BKCa）在神經(jīng)元胞體、突觸、終末端廣泛表達(dá)。BKCa主要參與動(dòng)作電位復(fù)極化和快速超極化，形成fastAHP（FAHP）。AHP電流參與神經(jīng)元峰電位頻率適應(yīng)過程，影響神經(jīng)元位相型放電和連續(xù)放電，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性［5］。BKCa開放時(shí)引起K＋外流，使神經(jīng)元內(nèi)陽離子降低，促進(jìn)動(dòng)作電位復(fù)極化和超極化的形成，從而使神經(jīng)元的興奮性降低。因此，BKCa通道的開放可能在癲癇發(fā)病機(jī)制中起到保護(hù)作用?；谝陨腺Y料，我們試圖進(jìn)一步研究作為內(nèi)源性抗癲癇物質(zhì)的腺苷，其作用靶點(diǎn)是否在BKCa通道，以及如何影響B(tài)KCa通道變化。

1 材料與方法

1.1 材料

乳鼠（SD 大鼠新生24h之內(nèi)），由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。DMEM 培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶干粉、Neurobasal培養(yǎng)液、B27添加劑，均為Gibco公司產(chǎn)品，4－氨基吡啶（4－AP）、腺苷干粉為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。玻璃電極購于南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠，用兩步法拉制。細(xì)胞外液成分（mmol／L）：NaCl 144，KCl 6，CaCl2×2H2O 2，MgCl2×6H2O 1.2，HEPES 10，D－Glucose 10，4－AP 5，pH 7.4。電極內(nèi)液成分（mmol／L）：K－Glutamine 110，KCl 20，Na2ATP 3，EGTA 0.1，MgCl2×6H2O 3，HEPES 10，D－Glucose 10，pH 7.35。

1.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離與培養(yǎng)

SD 大鼠為24h內(nèi)的新生乳鼠，取海馬后在4℃PBS平衡液中清除血管。用眼科剪將組織剪碎后在0.125%胰酶37℃消化15min，然后用含有10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液終止消化5 min。用尖端拋光的巴氏管吹打20下，200目篩網(wǎng)過濾后，濾液800 r／min離心4min，棄去上清。用DMEM－F12培養(yǎng)液混勻細(xì)胞沉淀成細(xì)胞懸液，種植于包被過的35 mm 培養(yǎng)皿中。24h 后用Neurobasal－B27 培養(yǎng)液全換液，以后每3d半換液，培養(yǎng)6～8d的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用MAPⅡ鑒別神經(jīng)元表面標(biāo)志。

1.3 膜片鉗記錄

在倒置顯微鏡下選擇形態(tài)典型的神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。玻璃微電極拉制后尖端直徑為1～2μm，充灌電極內(nèi)液后電阻2～4 MΩ。實(shí)驗(yàn)用EPC10膜片鉗放大器，調(diào)節(jié)三維顯微操縱器，使玻璃電極尖端與細(xì)胞表面接觸，稍加負(fù)壓形成高阻抗封接后，再加負(fù)壓形成全細(xì)胞記錄模式。記錄前進(jìn)行快慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償（達(dá)80%）。數(shù)據(jù)采集和分析用Pulse軟件（HEKA，德國）。用細(xì)胞外液灌流，封接，破膜，全細(xì)胞記錄模式形成后，待電流穩(wěn)定5min后開始記錄。實(shí)驗(yàn)均在24℃下進(jìn)行。

1.4 藥品配制

腺苷是水溶性，直接溶于細(xì)胞外液中配成母液，－20℃冰箱凍存。記錄電流前用細(xì)胞外液配成相應(yīng)的濃度（1、10、100μmol／L），以細(xì)胞旁方式給藥。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為消除細(xì)胞大小對電流大小的影響，所有數(shù)據(jù)都采用電流密度（Id），即單位細(xì)胞面積上的電流（電流／細(xì)胞電容，pA／pF），以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。加藥前后的Id采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；用Boltzmann方程對電流的激活曲線進(jìn)行擬合。所有圖表都由Excel 2003和Sigmaplot10.0制成。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)6～8d的細(xì)胞在高倍鏡下可見：海馬神經(jīng)元胞體呈梭形、橢圓形、三角形和多角形不等；突起很明顯，特別是樹突粗大可有分支；狀態(tài)較好的神經(jīng)元胞體較厚，立體感強(qiáng)，周圍可見光暈，看不到明顯的胞核。背景細(xì)胞中可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。MAPⅡ免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可見神經(jīng)元胞體和突起均呈紅色，背景下可見少許非特異性染色，未見其他背景細(xì)胞著色（圖1）。

圖1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of hippocampal neurons

2.2 海馬神經(jīng)元BKCa通道的電流特點(diǎn)

保持鉗制電壓為－80mV，給予從－40mV 到＋60mV 的脈沖刺激，階躍電壓為10 mV，可以引出一串幅值較大（nA）快速激活、幾乎不失活的外向電流。隨著測試電壓的增大，BKCa電流幅值不斷增大，并表現(xiàn)出外向整流的特性。給予選擇性BKCa通道阻斷劑CdCl2100μmol／L，可使BKCa電流顯著減小，給藥前后Id分別為（0.44±0.06）pA／pF 和（0.25±0.08）pA／pF，抑制率為（43.18±1.56）%（P＜0.05，n＝6），見圖2、3。

2.3 不同濃度腺苷對海馬神經(jīng)元BKCa通道的影響

以細(xì)胞旁給藥方式分別加入1、10、100μmol／L的腺苷后可以看到電流幅值較加藥前增大，加藥后的電流（Id）較加藥前的增長幅度分別為（3.35±1.72）%（n＝6，P＜0.05），（8.87±2.91）%（n＝7，P＜0.05），（20.53±5.40）%（n＝6，P＜0.05），濃度越高，增長幅度越大。

2.4 100μmol／L腺苷對BKCa通道Ⅰ－Ⅴ曲線的影響

100μmol／L 腺苷可使BKCa通道Ⅰ－Ⅴ曲線上移，從圖4可以看出，隨著命令電壓的增大，電流增長的幅度也加大，說明腺苷對BKCa電流的作用具有電壓依賴性。但加藥前后電流達(dá)到峰值的電位和電流持續(xù)時(shí)間沒有明顯改變（n＝6，P＜0.05）。

圖2 海馬神經(jīng)元BKCa通道的電生理特性Fig.2 Electrophysiological properties of BKCachannels in hippocampal neurons

圖3 CdCl2（100μmol／L）可顯著降低BKCa通道電流Fig.3 Decreased current of BKCachannels by CdCl2（100μmol／L）

圖4 腺苷（100μmol／L）對海馬神經(jīng)元BKCa通道的影響Fig.4 Effect of adenosine（100μmol／L）on BKCachannels in hippocampal neurons

2.5 100μmol／L腺苷對BKCa通道激活曲線的影響

以相應(yīng)電壓下電導(dǎo)與最大電導(dǎo)的比值對應(yīng)階躍刺激作圖，以Boltzmann方程：G／Gmax＝1／（1＋Exp（－（V－V1／2）／K））擬合曲線，V1／2為50%最大激活時(shí)的膜電位（mV），K 為激活曲線的斜率，G 為各個(gè)膜電位下測定的電流值，V 為各膜電位。從擬合圖形（圖5）分析數(shù)據(jù)得出：腺苷使激活曲線負(fù)向漂移［對照組V1／2（16.50±2.33），K（1.11±0.98）；腺苷組V1／2（9.83±1.20），K（1.04±0.60）；n＝6，P＜0.05］。

圖5 腺苷（100μmol／L）使海馬神經(jīng)元BKCa通道激活曲線負(fù)向漂移Fig.5 Effect of adenosine at 100μmol／L on the activated curve of BKCain hippocampal neurons

3 討論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)在原代培養(yǎng)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元上可以記錄到BKCa通道電流，選擇性BKCa通道阻斷劑CdCl2可以顯著抑制BKCa通道電流。腺苷（1、10、100μmol／L）可以增大BKCa電流，且具有濃度依賴性。腺苷（100μmol／L）可以電壓依賴性增大BKCa電流，使BKCa電流的激活曲線負(fù)向漂移，即使通道激活加快。

BKCa與癲癇的聯(lián)系非常密切，Du 等［6］觀察到BKCaα亞基的突變可以導(dǎo)致全身性癲癇的發(fā)作。Brenner等［7］證實(shí)BKCaβ4亞基可以降低齒狀回的興奮性，防止顳葉癲癇發(fā)作。Huang等［8］用單通道和全通道記錄方法證實(shí)唑尼沙胺的抗癲癇作用部分上是通過激活BKCa通道引起的。Shanley等［9］發(fā)現(xiàn)來普?。ㄒ环N體重調(diào)節(jié)藥）可以通過磷酸肌醇激酶3激活BKCa通道來介導(dǎo)神經(jīng)抑制作用。BKCa作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性通道的認(rèn)識(shí)越來越深入。原位雜交和放射配體技術(shù)表明BKCa通道m(xù)RNA 在腦中下列區(qū)域表達(dá)明顯增高：大腦皮層、松果體、海馬結(jié)構(gòu)的顆粒和錐體細(xì)胞層。BKCa通道在腦中的分布可能與其在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞中發(fā)揮作用有重要關(guān)系［10－11］。BKCa通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性中主要起以下幾方面的作用：①參與神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膹?fù)極化和超極化，影響動(dòng)作電位的時(shí)程；②形成快后超極化電位（fAHP），影響神經(jīng)元放電頻率；③降低細(xì)胞缺氧和其他損傷情況下過多鈣內(nèi)流，避免鈣超載；④減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸）釋放，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷［12－13］。BKCa通道開放時(shí)形成的鉀離子內(nèi)流以及對鈣離子內(nèi)流的負(fù)反饋?zhàn)饔?，不僅降低了神經(jīng)元的興奮性放電，同時(shí)也可以起到神經(jīng)保護(hù)作用。

Dunwiddie等［3］利用耐藥性癲癇模型研究證實(shí)腺苷水平降低是促進(jìn)癇樣放電向癲癇持續(xù)狀態(tài)演變的關(guān)鍵因素，本課題組之前的大量研究也發(fā)現(xiàn)慢性癲癇點(diǎn)燃模型腺苷受體表達(dá)明顯降低，腺苷抑制系統(tǒng)作用的喪失導(dǎo)致癲癇發(fā)作持久存在。因此，研究腺苷的作用靶點(diǎn)對癲癇的治療有很大的意義。研究證實(shí)，腺苷可以通過增加鉀通道電導(dǎo)來降低突觸前和突觸后興奮性信號傳遞，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮和突觸效能，這可能是其發(fā)揮抗癲癇作用的機(jī)制［14－16］。而BKCa通道作為形成靜息膜電位和動(dòng)作電位的重要通道可能參與了腺苷的調(diào)節(jié)機(jī)制，在大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜上已經(jīng)證實(shí)腺苷作用于BKCa通道引起血管舒張［17］。

本實(shí)驗(yàn)首先在培養(yǎng)的第6～8天大鼠海馬神經(jīng)元上記錄BKCa電流，其具有電壓依賴性和鈣激活特性，可被特異性鉀通道阻斷劑阻斷，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［13］。在此基礎(chǔ)上，選取腺苷3 個(gè)可能的有效濃度，證實(shí)腺苷可以增大BKCa電流，且在所選范圍內(nèi)有濃度依賴性。同時(shí)腺苷可使BKCa通道I－V 曲線上移，但不同的電壓下電流增大的幅度不同，電壓越大，電流增加的幅度越大，說明腺苷對BKCa電流的增大作用具有電壓依賴性，但是腺苷的這種作用沒有改變通道的激活電位及電流持續(xù)時(shí)間，推測腺苷可能是通過增加BKCa通道開放的數(shù)量來增加鉀電導(dǎo)的。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，腺苷可以使激活曲線負(fù)向漂移，即激活加快，差異有顯著性。上述結(jié)果說明BKCa可能是腺苷發(fā)揮抑制性作用的一個(gè)作用位點(diǎn)。腺苷系統(tǒng)有A1，A2，A3三種受體，放射自顯影技術(shù)顯示存在于神經(jīng)系統(tǒng)海馬部位的主要是A1受體，該受體與腺苷有高親和力；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)A1受體是腺苷發(fā)揮突觸抑制，介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)的主要受體［18－19］；在大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜上，腺苷可作用于A1 受體通過cAMP依賴的PKA 使通道磷酸化，從而使BKCa通道構(gòu)象改變，引發(fā)通道開放［17］。因此，我們推測腺苷可通過作用于海馬神經(jīng)元A1受體（cAMP－PKA途徑）使BKCa通道開放引發(fā)一系列的保護(hù)效應(yīng)。

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