歸芪多糖延緩衰老作用的研究

蒲秀瑛 ，李 言，張偉杰，王恒瑞，王 鵬

蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels )的干燥根，是臨床常用藥，一般認(rèn)為其味辛，而性微溫，歸心、肝、脾三經(jīng)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)一步證明了當(dāng)歸活血化瘀、補血止痛等作用，同時還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸有抗炎、清除氧自由基、保肝利膽、保護(hù)腎臟、增強免疫功能等作用［1，2］。黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. 的干燥的根，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功能［3］。多糖(polysaccharide)是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，存在于近百種植物中，由于其生理活性強，細(xì)胞毒性低，毒副作用小，因此對植物多糖的研究已成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域［4］。

目前對各種中草藥中提取的多糖的藥理研究較多，當(dāng)歸和黃芪又是最常見的傳統(tǒng)中藥，且當(dāng)歸多糖與黃芪多糖分別為其重要活性化合物。本課題組研究表明，從一定比例的當(dāng)歸和黃芪中提取的歸芪多糖具有一定的抗氧化和保護(hù)肝損傷等作用［5，6］。本試驗通過建立衰老小鼠模型，觀察歸芪多糖的延緩衰老作用及其作用機制，為開發(fā)抗衰老天然藥物提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

當(dāng)歸，黃芪:均購自甘肅岷縣。藥材樣品分別經(jīng)甘肅省藥品檢驗所鑒定為當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 和膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥的根。

1.2 實驗動物

昆明種SPF 級小鼠50 只，2 月齡，體重(30 ±5)g，雌雄各半，由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供。動物許可證號:SCXK(甘)2009-0004。

1.3 主要試劑和儀器

RE-5286A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);ULTRA-TURRAX 378 型組織勻漿機(東莞市通用精工液壓機械工具廠);紫外分光光度計(南京麒麟分析儀器有限公司);MK3 型酶標(biāo)儀(成都一科儀器設(shè)備有限公司)。乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇(均為分析純)。維生素E 膠丸購于廈門星鯊制藥有限公司(批號091110)，D-半乳糖購于sigma 公司。過氧化氫測定(H2O2)試劑盒，批號:20100809;蛋白質(zhì)測定(考馬斯亮藍(lán)法)試劑盒，批號:20100725;谷胱甘肽過氧化物酶測定(GSH-PX)試劑盒，批號:20100728;黃嘌呤氧化酶(XOD)測定試劑盒，批號:20100809;羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒，批號:20100825 和單胺氧化酶(MAO)測定試劑盒，批號:20100809;均購于南京建成生物工程研究所。

1.4 歸芪多糖的制備

將當(dāng)歸與黃芪的混合物(1∶5)以10 倍量(體積質(zhì)量比)80%的乙醇回流提取2 次，每次2h;過濾得歸芪粗粉。歸芪粗粉中加入一定量的蒸餾水，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，然后加適量95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，過夜，抽濾，得歸芪多糖浸膏。用sevag 法除蛋白，在浸膏中加入正丁醇、氯仿混合溶液(正丁醇∶氯仿= 1∶5)，劇烈振搖20 min，離心，除去下層與交界處的變性蛋白，重復(fù)3～5 次;收集上層多糖溶液，減壓濃縮去除有機溶劑并得到歸芪多糖，測得其多糖含量為53.8%。

1.5 實驗動物分組及給藥

將小鼠隨機分為5 組，每組10 只，雌雄各半，分別為正常對照組、衰老模型組、VitE 組、歸芪多糖高劑量組(1g/kg)、歸芪多糖低劑量組(0.5 g/kg)。除正常對照組外，其余各組每日頸背部皮下注射D-半乳糖(0.5 g/kg)，1 次/d，正常對照組注射同劑量的生理鹽水。從第8d 開始，歸芪多糖高、低劑量組分別以1 和0.5 g · kg-1/d 的劑量灌胃，0.2 mL/次，1次/d，維生素E 組灌服0.1 g · kg-1/d 的維生素E溶液，0.2 mL/次，1 次/d，共計42 d。每日用剃毛器剃去所有小鼠背部被毛，暴露約2 cm×2 cm 的皮膚，歸芪多糖高劑量組(1 g/kg)和低劑量組(0.5 g/kg)分別以含30%甘油的歸芪多糖提取液擦拭背部皮膚，早晚各一次，共計42 d;其余各組以生理鹽水對背部皮膚進(jìn)行擦拭。

1.6 歸芪多糖對衰老小鼠血清中H2O2、肝組織中GSH-PX 和XOD 的測定

42 d 后，摘眼球取血后脫頸處死小鼠，分離血清，參照試劑盒說明書測定H2O2含量;同時摘取小鼠肝組織，低溫勻漿后加生理鹽水［肝重(g)/生理鹽水(mL)=1/9］，離心(4 ℃，2500 rpm ×30 min)后取上清，參照試劑盒說明書測定GSH-PX 和XOD的活力。

1.7 歸芪多糖對衰老小鼠腦組織中MAO 和皮膚羥脯氨酸含量的測定

取小鼠腦組織制成10%的組織勻漿，離心(4℃，2500 rpm)30 min 后取上清，參照試劑盒說明書測定MAO 活力;再分別取各組小鼠背部給藥部位皮膚，去毛及脂肪，用1∶1 丙酮-乙醚脫脂，切碎晾干，精密稱取20 mg，參照試劑盒說明書進(jìn)行Hyp 含量的測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 歸芪多糖對衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSHPX 活力和XOD 活力的影響

模型對照組與正常組相比，血清H2O2含量和肝組織XOD 活性明顯升高，GSH-PX 活性降低，說明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功，如表1 所示。

維生素E 和歸芪多糖均能降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD，活力差異極顯著(P ＜0.01)。且維生素E 與高低劑量歸芪多糖相比，無顯著性差異，提示高劑量歸芪多糖降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD 的作用與陽性對照藥物維生素E 的作用類似;而低劑量組H2O2含量和XOD的活力均低于維生素E 組的(P ＜0.05)，說明歸芪多糖濃度越高，衰老模型小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD 活力越低，抗衰老作用可能越強。

相比正常組，模型對照組肝組織GSH-PX 活性明顯降低，而經(jīng)維生素E 和歸芪多糖治療后GSHPX 活性明顯得到提高(P ＜0.01)，表明歸芪多糖可顯著提高衰老小鼠肝組織GSH-PX 的活性，且歸芪多糖高劑量組GSH-PX 活性與維生素E 組差異不顯著。

表1 歸芪多糖對衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSH-PX 和XOD 活力的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

表1 歸芪多糖對衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSH-PX 和XOD 活力的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

與衰老模型組相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;與VitE 組相比:▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01 vs Vitamin E

組別Group H2O2 含量H2O2content(mmol·L-1)XOD 活力XOD activity(U· mgprot-1)GSH-PX 活力GSH-PX activity(U· mgprot-1·min)正常對照組Normal 127.73 ±11.94★★ 18.65 ±3.17★★ 160.94 ±12.97★★衰老模型組Aging Model 199.12 ±21.3 26.94 ±2.24 77.59 ±6.68維生素E 組Vitamin E 144.51 ±12.15★★ 21.11 ±1.95★★ 153.24 ±11.16★★歸芪多糖高劑量組Higher dose 148.04 ±15.01★★ 20.99 ±1.46★★ 142.11 ±10.30★★歸芪多糖低劑量組Lower dose 171.38 ± 17.16★▲ 22.20 ±3.07★ 91.99 ±7.92★★▲▲

2.2 歸芪多糖對衰老小鼠大腦MAO 和皮膚中Hyp含量的影響

研究結(jié)果顯示(見表2):衰老模型組小鼠腦組織中MAO 水平較正常對照組高，兩者間差異極顯著(P ＜0.01)。衰老模型小鼠經(jīng)歸芪多糖干預(yù)后，腦組織MAO 的活力有所降低(P ＜0.05;P ＜0.01)，說明歸芪多糖可明顯降低衰老小鼠腦中MAO 的活力，并且隨多糖含量增高，效果愈加明顯。

同時顯示，歸芪多糖可顯著拮抗D-半乳糖的作用，不同劑量組(0.5 和1 g/kg)均能使皮膚組織中羥脯氨酸含量明顯回升(與模型組相比較)，且高劑量組略高于低劑量組，提示歸芪多糖提取物在改善小鼠皮膚膠原蛋白代謝、恢復(fù)衰老小鼠皮膚彈性方面具有一定的作用，且在本實驗劑量范圍內(nèi)，藥物濃度越高，對小鼠皮膚抗衰老的作用可能越強。

表2 歸芪多糖對衰老小鼠腦中MAO 和皮膚中Hyp 含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

表2 歸芪多糖對衰老小鼠腦中MAO 和皮膚中Hyp 含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

與衰老模型組相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;與VitE 組相比:▲P ＜0.05;Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲P ＜0.05 vs Vitamin E

組別Group Hyp 含量Hyp content(ug · mg-1)MAO 活力MAO activity(U· mgprot-1)正常對照組Normal 1.67 ±0.28★★ 9.23 ±0.64★★衰老模型組Aging Model 1.24 ±0.16 11.12 ±0.95維生素E 組Vitamin E 1.54 ±0.18★★ 9.51 ±0.71★★歸芪多糖高劑量組Higher dose1.47 ±0.19★★ 9.85 ±0.77★★歸芪多糖低劑量組Lower dose1.33 ±0.15★▲ 10.38 ± 0.85★▲

3 討論

本實驗通過D-半乳糖建立衰老小鼠模型，使小鼠全身代謝紊亂，脂質(zhì)過氧化亢進(jìn)，蛋白質(zhì)合成減少，造成神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能退化，另外，該模型動物的多種組織細(xì)胞的病理變化也符合自然衰老時所出現(xiàn)的病理改變，說明本實驗動物模型具有一定的可靠性，故可用于抗衰老藥物研究。

維生素E 可保護(hù)多價的不飽和脂肪酸免受氧化破壞，預(yù)防和阻止誘發(fā)脂質(zhì)的過氧化，減少過氧化脂質(zhì)的生成，維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)［7］。是公認(rèn)的具有抗衰老作用的一種抗氧化劑，因此，以維生素E 作為對照藥物來比較歸芪多糖的抗衰老作用。

自由基學(xué)說［8，9］認(rèn)為自由基能引起細(xì)胞發(fā)生不可逆的損壞，導(dǎo)致細(xì)胞脆性增加、細(xì)胞斷裂、肌肉萎縮、記憶下降、智力減退，加速老化和衰老。從而增加有機體病變和死亡的可能性。因此，可以通過抑制或減少有機體組織中自由基的濃度而延長有機體的壽命。

本研究結(jié)果顯示:模型對照組小鼠血清中H2O2顯著上升，提示H2O2的大量堆積使H2O2攻擊機體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，加速機體的衰老進(jìn)程，可能是小鼠衰老的原因之一，而歸芪多糖可明顯降低D-半乳糖致衰老小鼠血清中H2O2含量，可能的原因是歸芪多糖提升了衰老小鼠血清中CAT(catalase，過氧化氫酶)的活力，CAT 清除自由基和H2O2，使H2O2含量降低，減少自由基對機體的損害。

GSH-PX 是有機體內(nèi)一個能夠幫助清除自由基的酶，人體隨著年齡的增長，血清和組織中的GSHPX 的活性會下降［10］。而XOD 是體內(nèi)核酸代謝中一種重要的酶，當(dāng)組織缺血缺氧時，XOD 活性會大大提高并催化黃嘌呤氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基，還可通過直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、激活產(chǎn)生氧化作用的炎癥細(xì)胞，對器官的氧化損傷和在相對防御功能薄弱的地方產(chǎn)生活性氧等直接造成組織損傷。

歸芪多糖作用于衰老小鼠后，其肝組織中GSHPX 的活性明顯升高，而XOD 的活性顯著減弱(P ＜0.01)，提示歸芪多糖可能通過提高小鼠肝組織中GSH-PX 的活性和降低XOD 的活性增強了機體清除自由基的能力，保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，延緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而起到一定的抗衰老作用。

單胺氧化酶(MAO)與衰老也是密切相關(guān)的，在正常肝、腎、大腦、腦于等區(qū)活動性較強，可催化單胺氧化脫氨基，參與神經(jīng)元去甲腎上腺素、5-羥色胺等遞質(zhì)的分解［11］。

哺乳動物及人類皮膚的老化與膠原蛋白有著密切關(guān)系，而膠原蛋白組成中羥脯氨酸占12 %～14%，含量高且穩(wěn)定的羥脯氨酸成分是膠原蛋白的一大特點，因此可通過定量測定皮膚中膠原蛋白含量或直接測定羥脯氨酸含量作為皮膚衰老程度的指標(biāo)。

本研究顯示，不同劑量的歸芪多糖(0.5 和1 g/kg)可明顯抑制D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中MAO 活性的升高(P ＜0.01)，而MAO 活性下降有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，對機體的抗氧化及抗衰老有促進(jìn)作用。且能提高D-Gal 致衰老小鼠皮膚中的Hyp 含量(P ＜0.05，p ＜0.01)，減緩皮膚皺縮、松弛，提示其可能促進(jìn)膠原蛋白合成，起到抗皮膚衰老的功效。

4 結(jié)論

本實驗采用人工復(fù)制催老動物模型的方法建立衰老小鼠，使衰老小鼠組織在功能上發(fā)生變化，再通過灌服不同劑量的歸芪多糖來研究歸芪多糖的抗衰老作用及機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):歸芪多糖通過降低小鼠血清H2O2含量，抑制腦組織MAO 和肝組織XOD活性，提高肝組織GSH-PX 活力及皮膚Hyp 的含量，來增強機體對自由基損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)能力，減輕自由基對生物大分子的攻擊，從而起到抗氧化和抗衰老的作用，這為進(jìn)一步研究抗衰老的藥物提供了有力的實驗依據(jù)。

1 Zhang Y(張艷)，Li WP(李衛(wèi)平)，Ming L(明亮)，et al.Hydrocortisone induced decrease of learning and memory functions in rats and its related to oxygen free radical. Acta Pharmaceutica Sinica(藥學(xué)學(xué)報)，2000，35:417-420.

2 Nie XY(聶小燕)，Chen Q(陳青)，Li Z(李祝). Advances in study on pharmacological activities of Angelica polysaccharides.Mod Agr Sci (現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008，15(10):37-41.

3 Yang JQ(楊金泉)，He HB(何海波).Progress in studies on pharmacological effect of Astragalus. J Med Theor＆Pra (醫(yī)學(xué)理論與實踐)，2010，23:148-150.

4 Liu X(劉霞)，Xie JX(謝建新)，Li Y (李艷).多糖的藥理作用研究.Agr Rec Med (農(nóng)墾醫(yī)學(xué))，2004，26:37-39.

5 Pu XY(蒲秀瑛)，Li Y(李言)，Wang P(王鵬). Study on antioxidant activity of Guiqi polysaccharide in vitro. Food Beverage Ind(中國食品工業(yè))，2011，1(193):64-66.

6 Pu XY ，Li Y，Zhou LY.Deferring senile effect of polysaccharides from Angelica and Astragalus on aging mice. International Conference on Human Health and Biomedical Engineering，2011，2:289-292.

7 Zhang SG(張石革).Vitamin E and anti aging.Chin Pharm(中國藥房)，2005，16:1839-1840.

8 Chen HH(陳紅紅)，Li ZL(李助樂)，Zhang J(章健).Study on the anti-aging effect of Flavonoids in Hickory leaf.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20:892-895.

9 Zhao LF(趙蓮芳)，Zheng YS(鄭玉淑)，Piao HS(樸惠順)，et al. Antisenility effects of astragalus polysaccharide and total ginsenoside on senile mice.J Med Sci Yanbian University(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報)，2006，29:249-251.

10 Stojiljkovic V，Todorovic A，Kasapovic J，et al. Antioxidant enzyme activity in rat hippocampus after chronic and acute stress exposure.Ann N Y Acad Sci，2005，1048:373-376.

11 Todorova I，Simeonova G，Kyuchukova D，et al. Reference values of oxidative stress parameters (MAO，SOD，CAT)In dogs and cats.Comp Clin Path，2005，13:190-194.