雙水相體系萃取人參根中人參皂苷的研究

張 儒，張變玲，謝 濤，李谷才，田 竟，羅志勇

1湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湘潭411104;2中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子生物學(xué)研究中心，長(zhǎng)沙410078

人參(Panax ginseng C. A. Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物，自古以來(lái)?yè)碛小鞍俨葜酢钡拿雷u(yù)，更被東方醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“滋陰補(bǔ)生，扶正固本”之極品。人參中含有皂苷、多糖和氨基酸等多種化學(xué)成分，其中主要藥用成分為人參皂苷。目前已從人參根中分離出如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Re、Rh 和Rf等50 余種人參皂苷，研究證明大多數(shù)人參皂苷單體具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)免疫力等活性，已廣泛應(yīng)用于臨床［1-5］。目前提取人參皂苷的方法有多種，如超聲波提取法、回流提取法、浸漬法和微波法等［5］。提取的溶劑主要為甲醇、乙醇和正丁醇等，但是這些有機(jī)溶劑對(duì)非皂苷類物質(zhì)也具有較高的溶解性，使得提取純度和效率較低。雙水相萃取 (aqueous two-phase extraction，ATPE)是利用物質(zhì)在兩相的分配差異進(jìn)行提取的新型分離技術(shù)。不僅具有分離過(guò)程條件溫和、不存在有機(jī)溶劑殘留、處理容量大和易連續(xù)化操作等特點(diǎn)，還具有分相時(shí)間短、目標(biāo)產(chǎn)物分配系數(shù)大、投資費(fèi)用少、安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［6，7］，在天然藥物活性成分的規(guī)模化生產(chǎn)方面具有很大的潛力。國(guó)內(nèi)外有將雙水相體系用于天然活性成分提取分離的研究，但是利用其從人參中萃取人參皂苷的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究人參粗提液在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配行為，以探索提取人參皂苷的最佳條件，為人參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料及主要試劑

人參根采集自吉林撫松，經(jīng)湖南省藥品檢驗(yàn)所趙勇鑒定為人參(P. ginseng C. A. Meyer);人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;PEG、硫酸銨和香草醛等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

WND-200 型高速中藥粉粹機(jī)(浙江蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司);BS323S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-100B 超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司);RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠);UV-2102PCS 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司);5418 型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)。

2 方法

2.1 人參粗提液的制備

［5］方法，取新鮮人參根自然風(fēng)干至水分含量為0.5%，粉碎后用20 目篩過(guò)篩。稱取200.0 g，加入2 L 雙蒸水，室溫浸泡過(guò)夜，60 ℃超聲提取3 次，每次30 min，抽濾，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至20 mL，濃縮液即為人參粗提液。

2.2 人參皂苷含量測(cè)定

以人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用香草醛-高氯酸顯色法檢測(cè)人參粗提液中總皂苷含量。精密稱取人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加甲醇溶解定容至10 mL。分別移取上述溶液0.0、10、20、30、40、50、60、70 和80 μL 至具塞試管，60 ℃水浴中蒸干甲醇，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混勻。60 ℃水浴中加熱15 min，立即用自來(lái)水冷卻。最后加入5 mL 的冰醋酸搖勻，于全波段掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為552 nm。552 nm測(cè)定各樣品吸光度值，以人參皂苷Re 濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1.589x +0.0112 (r =0.9991)，結(jié)果表明:人參皂苷Re 在10.0～80.0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。人參皂苷樣品均以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定。

2.3 雙水相體系建立

參考文獻(xiàn)［8］方法，將不同分子量的PEG 和(NH4)2SO4制成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原液，準(zhǔn)確量取一定量的PEG 原液，加入50 mL 離心管中，然后加入(NH4)2SO4原液，混合，直至溶液開(kāi)始出現(xiàn)混濁為止，記錄加入(NH4)2SO4的 量，算 出 PEG 和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再加入適量蒸餾水，使體系變澄清，計(jì)量加入蒸餾水的量，并繼續(xù)加入(NH4)2SO4原液，使系統(tǒng)再次變混濁，如此反復(fù)操作，計(jì)算混濁時(shí)PEG 和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分含量，從而繪制相圖。根據(jù)相圖規(guī)律確定穩(wěn)定成相體系，進(jìn)一步確定PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的最佳萃取配比。

2.4 雙水相體系萃取人參皂苷

根據(jù)上述雙水相相圖，計(jì)算雙水相體系所需各成相物質(zhì)的質(zhì)量。分別稱取一定量的PEG、(NH4)2SO4加蒸餾水配成雙水相體系，然后加入1 mL 人參粗提液，再用蒸餾水定容，振蕩，充分混合均勻，靜置1 h，待萃取充分后，分別移出上相和下相，測(cè)定人參皂苷濃度，并計(jì)算體積比(R)、分配系數(shù)(K)和回收率(Y)。相關(guān)參數(shù)定義如下:R = Vt/Vb;K=Ct/Cb;Y=RK/(1 +RK)。其中Vt、Vb 分別為上、下相體積(mL)，Ct、Cb 分別為上、下相人參皂苷濃度。影響雙水相體系萃取的因素較多，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEG 和(NH4)2SO4組成的雙水相體系中，靜置1 h 使人參皂苷萃取完全，萃取時(shí)間變化對(duì)人參皂苷的回收率影響較小。因而重點(diǎn)考察PEG 分子量、PEG/(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 和溫度對(duì)人參皂苷萃取的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系相圖

圖1 為采用濁點(diǎn)法以不同(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，得到的雙水相體系相圖。圖1 顯示隨著PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，對(duì)應(yīng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同情況下，隨著PEG 分子量增加，形成雙水相體系所需的PEG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低;相反，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，形成雙水相體系所需的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，從圖中發(fā)現(xiàn)，雙水相體系的成相范圍為:(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)5. 1%～24.8%，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.7%～58.3%，在雙結(jié)線的上方才能形成雙水相，靠近臨界點(diǎn)的體系對(duì)PEG 的消耗量少，形成兩相較難;遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)則比較容易，體系對(duì)PEG 的消耗量多，過(guò)多PEG 使體系的粘度增加，兩相分離的時(shí)間延長(zhǎng)。制備相圖時(shí)亦發(fā)現(xiàn)在PEG/(NH4)2SO4體系中，盡管在雙節(jié)點(diǎn)線上方成相范圍內(nèi)，但是(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%～22%，PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～30%的雙水相體系兩相間有穩(wěn)定的電位差，適合建立萃取人參皂苷的雙水相體系。故選擇14%(NH4)2SO4和30%不同分子量PEG 組合萃取人參皂苷，進(jìn)而篩選出合適分子量的PEG。

圖1 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系相圖Fig.1 The phase diagram of PEG/(NH4)2SO4 ATPS

3.2 不同分子量PEG 對(duì)人參皂苷萃取的影響

根據(jù)相圖，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的不同分子量(400、1000、3350 和6000)PEG 和14% (NH4)2SO4分別組成雙水相體系在pH 7、室溫條件下萃取人參皂苷，并分別測(cè)定R、K 和Y，結(jié)果見(jiàn)表1。在雙水相體系中，由于聚合物分子量的增加，分子內(nèi)極性基團(tuán)的比例相對(duì)降低，從而導(dǎo)致極性和親水性減小;PEG相和(NH4)2SO4相間的疏水性程度差距拉大，增加了相界面張力。并且PEG 分子量越大，體系的粘度越大，分相時(shí)間延長(zhǎng)，分相困難。因此，合適的PEG分子量可能使PEG 相的極性和親水性與人參皂苷較為接近，有利于其對(duì)人參皂苷的萃取。但是當(dāng)PEG 分子量過(guò)大時(shí)，溶液中的PEG 分子間的作用力增大，相粘度增大，使皂苷分子不易進(jìn)入PEG 相。從表1 結(jié)果看出人參皂苷在PEG3350 雙水相體系中的分配系數(shù)最大，人參皂苷回收率最高。因此，PEG3350 比較適合人參皂苷萃取。

表1 不同分子量PEG 對(duì)人參皂苷萃取的影響Table 1 Effect of the molecular weight of PEG on the extraction of ginsenosides

3.3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG3350 與(NH4)2SO4 對(duì)人參皂苷萃取的影響

以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 PEG3350 和 14%(NH4)2SO4分別組成雙水相體系，在pH 7、室溫條件下萃取人參皂苷，分別測(cè)定R 和K，計(jì)算回收率Y，結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖中可知，隨著PEG3350 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，Y 先增加后逐漸減小，在PEG3350 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% 時(shí)達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)選擇12%PEG3350 與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4分別組成雙水相體系萃取人參皂苷，結(jié)果見(jiàn)圖3，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%時(shí)人參皂苷回收率最高。

3.4 pH 對(duì)人參皂苷萃取的影響

人參皂苷分子中含有羥基和甲基，pH 值影響人參皂苷的電性和極性，同時(shí)也影響PEG/(NH4)2SO4體系的相間電位，從而影響人參皂苷在雙水相體系中的分配。本實(shí)驗(yàn)以12% PEG3350 與16%(NH4)2SO4組成的雙水相體系，室溫萃取條件下考察其在不同pH 值對(duì)人參皂苷萃取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4 可以看出，pH 值越大，回收率Y 隨著pH 值的增大而減小。當(dāng)pH 值為7.0 時(shí)，回收率最高，故選取pH 值為7.0。

圖4 不同pH 值對(duì)人參皂苷萃取的影響Fig.4 The effect of pH value on the extraction of ginsenosides

3.5 溫度對(duì)人參皂苷萃取的影響

溫度影響溶劑的活度和相的聚合物組成，溫度高有利于傳質(zhì)，但是過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致人參皂苷分解。在12% PEG3350 與16% (NH4)2SO4組成的雙水相體系中，pH 值為7.0 的條件下，考察不同溫度對(duì)人參皂苷萃取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中表明，隨著溫度的升高，萃取回收率逐漸上升，最高可達(dá)到88.94%，溫度超過(guò)60 ℃后，回收率迅速下降。其原因可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致人參皂苷部分分解，故選定最適溫度為60 ℃。

圖5 不同溫度對(duì)人參皂苷萃取的影響Fig.5 The effect of temperature on the extraction of ginsenosides

4 結(jié)論

綜上所述，利用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系萃取人參皂苷的方法可行。萃取人參皂苷的最佳雙水相體系組合為PEG3350/(NH4)2SO4，其最佳體系為12% PEG3350，16% (NH4)2SO4，pH 7. 0，溫度60 ℃。該體系對(duì)人參根提取物中人參皂苷有著較好的萃取效果。利用該體系萃取人參皂苷，回收率可達(dá)88.94%。該體系具有溶劑殘留少、萃取高效安全和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為人參皂苷萃取分離提供了一種新的有效方法。

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