殼寡糖對(duì)環(huán)江香豬生化參數(shù)及腸道菌群組成的影響

連國(guó)琦，周笑犁，孔祥峰 ，馮澤猛，印遇龍

1中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410125;2南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330047;3 中國(guó)科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站，環(huán)江547100;4 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100039

自20 世紀(jì)50 年代報(bào)道在飼料中添加抗生素具有促生長(zhǎng)效果以來(lái)，抗生素便被作為促生長(zhǎng)劑而被廣泛用于飼料添加劑?？股氐拈L(zhǎng)期使用在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量的同時(shí)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)，如抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留，濫用抗生素引起的內(nèi)源感染、二重感染及耐藥菌株的產(chǎn)生，這都會(huì)造成畜禽免疫功能的低下和畜產(chǎn)品品質(zhì)的下降［1］。近年來(lái)，我國(guó)也不斷發(fā)布有關(guān)抗生素和藥物飼料添加劑方面的規(guī)章制度，逐步減少抗生素等藥物的使用量和使用品種。殼聚糖是甲殼素的重要衍生物，是甲殼素脫乙酰度達(dá)到70%以上的產(chǎn)物，是除蛋白質(zhì)以外含氮量最大的有機(jī)氮源，也是自然界中唯一的堿性多糖。但由于殼聚糖不溶于水，其開(kāi)發(fā)應(yīng)用受到很大限制［2］。殼寡糖(COS)學(xué)名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是將殼聚糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)處理而得到的一種全新產(chǎn)品，作為一種純天然、無(wú)污染的物質(zhì)，其資源豐富、生物活性高、無(wú)毒副作用，可被機(jī)體快速吸收，實(shí)際應(yīng)用中問(wèn)題較少，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，前景廣闊［3］。本試驗(yàn)測(cè)定了COS 對(duì)斷奶環(huán)江香豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和腸道微生物的影響，旨在為開(kāi)發(fā)綠色環(huán)保型飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、飼養(yǎng)管理及分組

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2009 年6 月在廣西環(huán)江東興鎮(zhèn)某香豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。選用21 日齡斷奶的環(huán)江香豬12頭，隨機(jī)分成2 組，每組6 頭。按中國(guó)地方豬營(yíng)養(yǎng)需要量［4］并結(jié)合NRC(1998)營(yíng)養(yǎng)需要量［5］配制基礎(chǔ)日糧。對(duì)照組在基礎(chǔ)日糧中添加抗生素，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%的COS。日糧中加入2 倍水后，調(diào)成粥狀飼喂。日喂3 次，自由采食和飲水。預(yù)試期按常規(guī)免疫程序?qū)υ囏i進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)、防疫。正試期為14 d，期間每日觀察豬群的健康情況。

1.2 血漿生化參數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每頭試豬前腔靜脈采血10 mL，肝素抗凝，3000 rpm 離心10 min 分離血漿，用CX4 型全自動(dòng)生化分析儀(Beckman 公司產(chǎn)品)測(cè)定血漿總蛋白、白蛋白、尿素氮、血氨、免疫球蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯和膽固醇的含量及堿性磷酸酶的活性。測(cè)定方法按照試劑盒(由北京利德曼公司提供)說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 食糜采集與微生物DNA 提取

處死仔豬后，無(wú)菌收集回腸和盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后，-80 ℃保存。在提取DNA 前，樣品于4 ℃解凍，取約3 g 濕重的糞樣，移入50 mL 置于冰預(yù)冷的0.1%吐溫-80 中，充分渦旋，均質(zhì)化后，200 g 低速離心6 min 取上清，將上清12000 g 高速離心20 min棄上清，留沉淀。反復(fù)洗滌沉淀3 次至上清變澄清［6］。將提取的細(xì)菌分裝至1.5 mL 離心管中-70℃保存。按TIANGEN 公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取腸道細(xì)菌基因組總DNA，采用NanoDrop? ND1000(NanoDrop Technologies Inc.，DE，USA)測(cè)定DNA 的濃度，并以O(shè)D260/OD280 評(píng)價(jià)DNA 的純度。

1.4 腸道微生物的熒光定量PCR 分析

采用SYBR Green I 染料法，在熒光定量PCR 儀(ABI 7900HT)上進(jìn)行擴(kuò)增，并運(yùn)用Applied Biosystem SDS2.3 進(jìn)行定量PCR 數(shù)據(jù)分析。以最小Ct 值和最高熒光值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。最后確定反應(yīng)體系為20 μL:包括10 μL Takara SYBR Premix Ex Taq(2 ×，預(yù)混MgCl2、dNTP、SYBR Green I 染料、EX-Taq 聚合酶、buffer)，0.4 μL 引物(10 μM)，2 μL cDNA 模板，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。分別設(shè)計(jì)5 對(duì)引物(具體序列及產(chǎn)物見(jiàn)表1)，用于進(jìn)行樣品中雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Peptostreptococcus)、大腸桿菌(Escherichia)和總細(xì)菌基于16S rDNA 基因的相對(duì)定量。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃，3 min;95 ℃30 s、60 ℃60 s、72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。樣品DNA 的檢測(cè)采用3 個(gè)重復(fù)，取平均值。采用2-△△CT法［7］統(tǒng)計(jì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 相關(guān)引物Table 1 The primers of bacteria determined in real-time PCR

Lactobacillus Reverse - 5’-GAGCCTCAGCGTCAGTTG-3’大腸埃希菌 Forward- 5’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3’ 95 Escherichia Reverse - 5’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’鏈球菌 Forward - 5’-GATGGACCTGCGTTGTATTAGCT-3’ 277 Peptostreptococcus Reverse - 5’-CCCTTTCTGGTAAGATACCGTCAC-3’總細(xì)菌 Forward - 5’-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3’ 146 Total bacteria Reverse - 5’-CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步處理后，采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA 程序單因素方差分析對(duì)不同處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，以P ＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS 對(duì)環(huán)江香豬血漿生化參數(shù)的影響

由表2 可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，COS 組堿性磷酸酶活性顯著升高(P ＜0.05)，高密度脂蛋白、總蛋白和IgG 濃度均有增加趨勢(shì)(P ＞0.05)，低密度脂蛋白、血氨、甘油三酯、膽固醇和尿素氮濃度均有下降趨勢(shì)(P ＞0.05)。

表2 日糧添加殼寡糖對(duì)環(huán)江香豬血漿生化參數(shù)的影響(n=6)Table 2 Effect of dietary supplementing COS on plasma biochemical parameters in Huanjiang mini-piglets (n=6)

2.2 COS 對(duì)環(huán)江香豬腸道微生物的影響

使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取其總DNA 后，測(cè)定OD260 和OD280 的吸光值，所提取總DNA 的OD260/OD280 比值均在1.8～2.1 之間，說(shuō)明提取的DNA 無(wú)蛋白、RNA 和有機(jī)試劑的污染;對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，所有樣品的擴(kuò)增效率均較好，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均約為1500 bp(如圖1 所示)。

圖1 DNA-PCR 產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳代表性樣圖Fig.1 Representative PCR profile of bacterial genomic DNA

通過(guò)溶解曲線檢測(cè)所用引物的特異性，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的溶解曲線均相似，并沒(méi)有額外的峰存在，說(shuō)明可以排除非特異性擴(kuò)增的影響。如圖2 所示，雙歧桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、大腸桿菌和總細(xì)菌16S rDNA 基因的擴(kuò)增曲線均為單一的峰型，確認(rèn)所用引物的特異性較高。

由表3 可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，COS 組回腸乳酸桿菌數(shù)量顯著增加、鏈球菌數(shù)量顯著降低(P ＜0.05)，盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著增加、大腸桿菌和鏈球菌數(shù)量顯著降低(P ＜0.05)。

圖2 部分腸道細(xì)菌16S rDNA 基因的溶解曲線Fig.2 Dissociation curve of 16S rDNA fragments amplified from part of intestinal bacteria

表3 殼寡糖對(duì)環(huán)江香豬部分腸道細(xì)菌數(shù)量的影響(n=6)Table 3 Effects of dietary supplementing COS on part of intestinal bacteria in Huanjiang mini-piglets (n=6)

3 討論

中國(guó)的小型品種豬資源豐富，如環(huán)江香豬、巴馬香豬等。小型豬作為一種非嚙齒類動(dòng)物，其解剖學(xué)、生理學(xué)及營(yíng)養(yǎng)代謝特性與人類極為相似，正逐步成為研究人類疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［8］。香豬是我國(guó)乃至世界稀有的特小型豬種，具有獨(dú)特的種用價(jià)值，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)部列為國(guó)家畜禽出口管理二級(jí)保護(hù)品種［9］。鑒于環(huán)江香豬的飼養(yǎng)管理仍較為粗放，導(dǎo)致日糧中營(yíng)養(yǎng)成份不夠全面，豬的生長(zhǎng)發(fā)育較緩慢，若要大力發(fā)展香豬生產(chǎn)，首先要解決其飼料營(yíng)養(yǎng)及安全問(wèn)題。

關(guān)于COS 對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了不少研究，但結(jié)果不盡一致［10，11］。在本試驗(yàn)中，添加COS 14 d 后，斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能沒(méi)有改善，可能與寡糖添加時(shí)間短有關(guān)，估計(jì)添加較長(zhǎng)時(shí)間可能會(huì)有較好的飼料轉(zhuǎn)化率。

血清中的堿性磷酸酶與脂肪、糖類和蛋白質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、合成等過(guò)程密切相關(guān)［12］。血液尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，其濃度受飼料中蛋白質(zhì)含量與品質(zhì)的影響［13］。該濃度主要反映氨基酸在動(dòng)物體內(nèi)的代謝情況，過(guò)量的氨基酸在體內(nèi)進(jìn)行脫氨基作用會(huì)增加血液尿素氮的濃度［14］;氨基酸平衡狀況良好時(shí)，血液尿素氮濃度下降。本試驗(yàn)中，COS 組仔豬堿性磷酸酶活性顯著升高、血漿尿素氮濃度降低，說(shuō)明仔豬對(duì)日糧蛋白質(zhì)的利用能力增強(qiáng)。總蛋白濃度的升高，也表明仔豬對(duì)日糧蛋白質(zhì)的消化吸收作用加強(qiáng)，有助于組織蛋白質(zhì)的合成。由上可見(jiàn)，COS 可提高斷奶仔豬對(duì)日糧蛋白質(zhì)的利用，有助于組織蛋白質(zhì)的合成。周笑犁等也報(bào)道，在日糧中添加大豆寡糖可降低斷奶環(huán)江香豬血氨和尿素氮水平，改善蛋白質(zhì)代謝，還能提高機(jī)體中一些必需氨基酸的含量［15］。

動(dòng)物腸道菌可分為有益菌與有害菌，二者存在生理性動(dòng)態(tài)平衡。在微生態(tài)平衡狀態(tài)下，動(dòng)物腸道中的正常菌群對(duì)腸道的結(jié)構(gòu)、功能和健康具有重要作用［16］。健康個(gè)體中雙歧桿菌、乳酸桿菌等是正常優(yōu)勢(shì)菌群，細(xì)菌數(shù)可達(dá)1 ×1010～1 ×1011個(gè)/g;大腸桿菌和某些鏈球菌屬于腐敗性細(xì)菌，細(xì)菌數(shù)可達(dá)1×105～1 ×107個(gè)/g［17］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，COS 對(duì)大腸桿菌、鏈球菌等腸道有害菌有明顯的抑制作用，而對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌有明顯的促進(jìn)作用，這可能與不同腸道菌對(duì)低聚糖的利用情況不同有關(guān)。雙歧桿菌能夠很好地利用大多數(shù)功能性低聚糖，而腐敗梭菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌等有害菌則幾乎不能利用各種低聚糖［18］。也有資料表明，殼寡糖由于相對(duì)分子質(zhì)量小，易于透過(guò)細(xì)菌胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，使其細(xì)胞內(nèi)部起生物活性的相關(guān)酶發(fā)生泄露，同時(shí)與帶負(fù)電荷的物質(zhì)如DNA 相互作用，干擾DNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗微生物活性［19］。乳酸菌和雙歧桿菌在腸道內(nèi)能形成正常菌群并產(chǎn)生短鏈脂肪酸，使腸道酸度增加，從而抑制腸道內(nèi)不耐酸病原菌的繁殖，在動(dòng)物腸道內(nèi)還可產(chǎn)生細(xì)菌素、類細(xì)菌素、過(guò)氧化氫和某些有機(jī)酸等，并可黏附于腸道細(xì)胞上，產(chǎn)生占位性競(jìng)爭(zhēng)和營(yíng)養(yǎng)性競(jìng)爭(zhēng)作用［20，21］。

綜上所述，在日糧中添加COS 可以在一定程度上改善機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，并調(diào)控腸道微生態(tài)平衡，從而促進(jìn)腸道健康。

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