直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法輔助GC-MS 分析迷迭香揮發(fā)油

王方杰，劉 韶* ，袁干軍

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙410008;2 中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410013;

3江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045

迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)系唇形科常綠小灌木，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，主產(chǎn)于西班牙、摩洛哥、前南斯拉夫、保加利亞和突尼斯。近年來，我國(guó)南方地區(qū)也廣為栽種。迷迭香葉中富含揮發(fā)油，已廣泛用于食用香料、食品、日用化工和醫(yī)藥產(chǎn)品等領(lǐng)域，在醫(yī)藥方面，迷迭香精油對(duì)神經(jīng)衰弱、低血壓和肌肉疼痛有較好療效，具有一定的抗菌作用［1］和抗氧化活性［2］，還可能成為一種新的高效的抗癌藥物［3，4］。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)迷迭香精油成分的研究較多，已有報(bào)道［5-7］用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定迷迭香揮發(fā)性成分，并結(jié)合商業(yè)質(zhì)譜庫(kù)鑒定了其中含量高的、能基線分離的化合物。但由于迷迭香精油中含有一些性質(zhì)相近的組分，通過色譜條件優(yōu)化后，仍存在重疊色譜峰，尤其是含量低的峰常常跟含量高的組分一起流出，難以準(zhǔn)確鑒別和定量。在植物藥的篩選過程中，出現(xiàn)了許多含量低的化合物具有高生理活性或高毒性的實(shí)例，因而對(duì)迷迭香精油進(jìn)行準(zhǔn)確定性、定量分析有助于其開發(fā)利用。直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)(Heuristic Evolving Latent Projections，HELP)［8］是一種對(duì)二維色譜/光譜矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行解析的有效方法，已成功應(yīng)用于對(duì)芫荽［9］、千斤拔［10］、桂花［11］、紅薯葉［12］等揮發(fā)油的分析。本實(shí)驗(yàn)通過水蒸氣蒸餾法提取迷迭香中的揮發(fā)油成分，采用HELP 法解析GC-MS 二維數(shù)據(jù)，得到各組分的純色譜曲線和質(zhì)譜，通過質(zhì)譜庫(kù)檢索對(duì)分辨的組分進(jìn)行定性，采用總體積積分法進(jìn)行定量，準(zhǔn)確定性的47個(gè)化合物占總含量的99.79%。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，G3172A 質(zhì)譜工作站，NIST08 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)安捷倫公司);正己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無水硫酸鈉均為分析純。

1.2 揮發(fā)油的提取

迷迭香葉(產(chǎn)于廣西西林縣)粉碎成粗粉，取2000 g 迷迭香粗粉，采用水蒸氣蒸餾提取，得油水混合物2000 mL，用分液漏斗進(jìn)行油水分離，上層加入2 g 無水硫酸鈉用力振搖后，靜置脫水1 h，用移液槍吸取液體部分，得迷迭香精油23 mL，低溫保存，分析時(shí)用正己烷稀釋50 倍。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:HP-5MS 石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 μm×0. 25 mm);載氣為高純氦氣;流速為1 mL/min;進(jìn)樣口溫度270 ℃;程序升溫:初始柱溫50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min 速率升至250 ℃，保持20 min;分流比為50∶1;溶劑延遲4 min;進(jìn)樣量1 μL(以正己烷稀釋50 倍)。

質(zhì)譜條件:標(biāo)準(zhǔn)EI 源;離子源溫度:230 ℃;四級(jí)桿溫度:150 ℃;電子能量:70 eV;輔助接口溫度:280 ℃;掃描范圍:20～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用安捷倫質(zhì)譜工作站，檢索NIST08 質(zhì)譜庫(kù)，對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定;對(duì)于部分未完全分離的色譜峰，則使用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法-直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(Heuristic Evolving Latent Projections，HELP)進(jìn)行解析和比較分析，得到純色譜峰和純質(zhì)譜峰后，再與質(zhì)譜庫(kù)對(duì)照定性。采用總體積積分法和歸一法確定各化合物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HELP 方法

2.2 迷迭香揮發(fā)油成分的定性分析

迷迭香揮發(fā)性化學(xué)成分的GC-MS 總離子流圖見圖1。GC 圖約有40 個(gè)色譜峰，盡管不斷優(yōu)化色譜條件，仍有部分色譜峰發(fā)生重疊，一些看似純峰的色譜峰也是由混合組分重疊而成。若采用MS 庫(kù)直接檢索，定性結(jié)果就會(huì)不準(zhǔn)確，或色譜峰中匹配度較低的峰無法鑒別。揮發(fā)油定性分析主要采用G3172A 質(zhì)譜工作站檢索NIST08 質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行譜圖分析，對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定;對(duì)于部分未完全分離的色譜峰，則使用HELP 法進(jìn)行解析。

圖1 迷迭香揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of the essential oil of rosemary

以保留時(shí)間段16.20～16.65 min 的峰簇A 與時(shí)間段11.25～11.60 min 的峰簇B 為例加以說明。圖2 為峰簇A 與峰簇B 的總離子流圖，峰簇A 看似為2 個(gè)典型的純色譜峰。若直接從質(zhì)譜庫(kù)中檢索，只能檢測(cè)到2 個(gè)組分，且該峰簇后半部分不同位置質(zhì)譜變化很大，檢索結(jié)果與被測(cè)質(zhì)譜相似度很低，不同位置檢索結(jié)果也不相同。其中一個(gè)為bicyclo［2.2. 1］heptan-2-ol-2，3，3-trimethyl-，相似度僅為64%。峰簇B 為兩組份的重疊峰，若直接從質(zhì)譜庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)前半部分質(zhì)譜變化較大，檢索結(jié)果匹配度也較低。色譜峰的定性難以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)由于色譜峰重疊，難以進(jìn)行定量分析。

圖2 峰簇A 和峰簇B 的GC-MS 總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of peak cluster A and peak

首先用HELP［13，14］法解析峰簇A，先進(jìn)行背景扣除，得到該峰的秩圖(見圖3)。秩圖是化學(xué)組分在保留時(shí)間方向上的一種組分分布信息圖，能清楚顯示組分隨保留時(shí)間的變化情況。從圖3 中可知，該色譜峰含有3 種成分，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別代表三個(gè)不同的組分;Ⅰ+Ⅱ、Ⅱ+Ⅲ分別代表組分1 和2、2 和3 的重疊區(qū)。再根據(jù)確定的組分?jǐn)?shù)、各組分的選擇性區(qū)域和零組分區(qū)域進(jìn)行分辨，即得到這三種組分的純色譜曲線和MS 唯一解，再在MS 庫(kù)中對(duì)組分進(jìn)行相似性檢索，可知3 種組分分別是:樟腦，匹配度為98;5-甲基-2-異烯丙基環(huán)己醇，匹配度為95;2，3，3-三甲基二環(huán)［2.2.1］-2-庚醇，匹配度為94。HELP法解析出的色譜圖見圖4，其相應(yīng)的MS 見圖5。

如上所示再用HELP 法解析峰簇B，背景扣除后得到該峰的秩圖(圖3)。從圖3 可知，該峰含有2種成分，Ⅰ、Ⅱ分別代表2 種不同的組分;Ⅰ+Ⅱ代表組分4 和5 的重疊區(qū)。進(jìn)行分辨后得到這2 種組分的純色譜曲線和MS 唯一解，再在MS 庫(kù)中對(duì)組分進(jìn)行相似性檢索，可知2 種組分分別是:1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烯，匹配度為96;桉葉素，匹配度為95。HELP 法解析出的色譜圖見圖4，其相應(yīng)的MS 見圖6。

最后采用同樣的方法對(duì)其它的峰簇進(jìn)行解析，得到迷迭香揮發(fā)油的組分，結(jié)果見表1。

2.3 迷迭香揮發(fā)油成分的定量分析

采用總體積積分和歸一化法得到各組分的定量分析結(jié)果(見表1)，迷迭香定性組分占總含量的99.79%。

表1 迷迭香揮發(fā)油的成分及相對(duì)含量Table 1 the constituents and relative contents in the essential oil of rosemary

26 14.99 小茴香醇Fenchol，exo- C10H18O 154 0.076 91 27 15.34 (1α，2β，5α)-2-甲基-5-(1-甲乙基)-二環(huán)［3.1.0］-2-己醇Bicyclo［3.1.0］hexan-2-ol，2-methyl-5-(1-methylethyl)-(1α，2β，5α) C10H18O 154 0.044 90 28 15.51 2，6-二甲基-3，5-庚二烯-2-醇3，5-Heptadien-2-ol-2，6-dimethyl- C9H16O 140 0.036 96 29 15.56 6-莰烯酮Camphenol，6- C10H16O 152 0.015 94 30 16.32 樟腦Camphor C10H16O 152 7.608 95 31 16.43 5-甲基-2-異烯丙基環(huán)己醇Cyclohexanol，5-methyl-2-(1-methylethyl)- C10H18O 154 0.237 96 32 16.52 2，3，3-三甲基-二環(huán)［2.2.1］-2-庚醇Bicyclo［2.2.1］heptan-2-ol-2，3，3-trimethyl- C10H18O 154 0.065 94 33 16.89 1R-(1α，2β，5α)-5-甲基-2-異烯丙基環(huán)己醇Cyclohexanol，5-methyl-2-(1-methylethyl)-，1R-(1α，2β，5α)- C10H18O 154 0.080 96 34 17.07 2，6，6-三甲基-二環(huán)［3.1.1］-3-庚酮Bicyclo［3.1.1］heptan-3-one，2，6，6-trimethyl- C10H16O 152 0.049 97 35 17.18 2(10)-蒎烯-3-酮2(10)-Pinen-3-one C10H14O 150 0.019 91 36 17.31 龍腦Borneol C10H18O 154 2.431 97 37 17.40 α-萜品醇p-Menth-1-en-8-ol C10H18O 154 0.216 90 38 17.68 (1α，2α，5α)-2，6，6-三甲基-二環(huán)［3.1.1］3-庚酮Bicyclo［3.1.1］heptan-3-one，2，6，6-trimethyl-，(1α，2α，5α)- C10H16O 152 0.041 95 39 17.84 4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇3-Cyclohexen-1-ol，4-methyl-1-(1-methylethyl)- C10H18O 154 0.804 97 40 18.21 1a，2a-4-三甲基苯甲醇Benzenemethanol，1α，2α，4-trimethyl- C10H14O 150 0.036 95 41 18.25 隱品酮2-Cyclohexen-1-one，4-(1-methylethyl)- C9H14O 138 0.053 91 42 18.46 1α，2α，4-三甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇3-Cyclohexene-1-methanol，1α，2α，4-trimethyl- C10H18O 154 1.117 91 43 18.73 桃金娘醇(-)-Myrtenol C10H16O 152 0.052 90 44 18.96 4-亞甲基-1-(1-甲乙基)二環(huán)［3.1.0］-3-乙酸己酯Bicyclo［3.1.0］hexan-3-ol，4-methylene-1-(1-methylethyl)-acetate C12H17O2 194 0.013 97 45 19.06 氯化龍腦Bornyl chloride C10H17CL 172 0.032 91 46 19.26 馬鞭草烯酮D-Verbenone C10H14O 150 1.621 93 47 21.94 未知Unknown 0.066 48 22.71 乙酸龍腦酯Bornyl acetate C12H19O2 196 2.011 98 49 28.38 丁香烯Caryophyllene C15H24 204 1.426 99 50 29.78 α-丁香烯α-Caryophyllene C15H24 204 0.962 97 51 34.88 石竹烯氧化物Caryophillene oxide C15H24O 220 0.039 90 52 35.89 未知Unknown 0.023

3 討論

迷迭香揮發(fā)油的總離子流圖約有40 個(gè)色譜峰，部分色譜峰發(fā)生重疊，用MS 直接檢索可鑒別出匹配度＞90 的化學(xué)成分34 個(gè)，其他化學(xué)成分相似度降低，無法鑒別。HELP 法對(duì)不能鑒別出的重疊色譜峰進(jìn)行逐個(gè)解析，共鑒定出47 個(gè)化學(xué)成分。迷迭香精油中主要成分為α-蒎烯(44. 19%)、樟腦萜(13.80%)、樟腦(7.61%)、1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烯(3.61%)、乙酸龍腦酯(2.01%)、龍腦(2.43%)，其相對(duì)含量之和達(dá)到73. 65%，其中蒎烯、樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯等具有消炎鎮(zhèn)痛、解熱、抗菌的功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化學(xué)計(jì)量法輔助GCMS 聯(lián)用技術(shù)解析復(fù)雜體系如揮發(fā)油等二維數(shù)據(jù)中的重疊峰，是一種方便準(zhǔn)確的方法，比單獨(dú)使用GCMS 法更真實(shí)、全面地反映迷迭香中的揮發(fā)油成分。

1 Jiang Y，Wu N，F(xiàn)u YJ，et al.Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Rosemary. Environm Toxicol Pharmacol，2011，32:63-68.

2 Beretta G，Artali R，F(xiàn)acino RM，et al.An analytical and theoretical approach for the proling of the antioxidant activity of essential oils:the case of Rosmarinus officinalis L..J Pharm Biomed Anal，2011，55:1255-1264.

3 Wei FX(魏鳳香)，Li MY(李美玉)，Wang L(王琳)，et al.Experiment study of the cervical cancer Hela cell apoptosis induced by essential oil of rosemary.J Sun Yat-sen Univ，Med Sci(中山大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2008，29(3S):23-25.

4 Wang L(王琳)，Liu JX(劉君星)，Wei FX(魏鳳香)，et al.Experiment study of HepG2cell apoptosis induced by essential oil of rosemary. Chin J Gerontol(中國(guó)老年學(xué)雜志)，2008，28:2323-2325.

5 Zhao WJ(趙文軍)，Wu XP(吳雪萍). Studies on the extraction and composition analysis of the essential oil of rosemary.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2003，34:884-886.

6 Yosr Z，Taroub B，Mohamed B.Essential oils composition in two Rosmarinus officinalis L.varieties and incidence for antimicrobial and antioxidant activities. Food Chem Toxicol，2010，48:3144-3152.

7 Xu PX(徐鵬翔)，Jia WM(賈衛(wèi)民)，Bi LW(畢良武)，et al. Studies on chemical constituents of the essential oil of Rosmarinus officinalis L. from different regions. J Anal Sci(分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2003，19:361-363.

8 Liang YZ.White，Grey and Black Muticomponent System and Their Chemometics Algorithms(白灰黑復(fù)雜多組分分析體系及其化學(xué)計(jì)量學(xué)算法). Changsha(長(zhǎng)沙):Hunan Publishing House of Science and Technology(湖南科學(xué)技術(shù)出版社)，1996:177-206.

9 Zhou ZF，Chen LY，Shen M，et al. Analysis of the essential oils of Coriandrum sativum using GC-MS coupled with chemometric resolution methods. Chem Pharm Bull，2011，59:28-34.

10 Xie JW，Hu W，Zhou ZL，et al.Determination of the volatile constituents in Radix Flemingiae Philippinensis by GC-MS and a heuristic evolving latent projection. Molecules，2010，15:4055-4066.

11 Hu CD，Liang YZ，Li XR，et al.Essential oil composition of Osmanthus fragrans varieties by GC-MS and heuristic evolving latent projections. Chromatographia，2009，70:1163-1169.

12 Wang M，Xiong YH，Zeng MM，et al.GC-MS Combined with chemometrics for analysis of the components of the essential oils of sweet potato leaves. Chromatographia，2010，71:891-897.

13 Kvalheim OM，Liang YZ. Heuristic evolving latent projections:resolving two-way multicomponent data. Part 1. Selectivity，latent projective graph，datascope，local rank and unique resolution.Anal Chem，1992，64:936-946.

14 Hang YZ，Kvalheim OM，Keller HR，et al.Heuristic evolving latent projections:resolving two-way multicomponent data.Part 2:Detection and resolution of minor constituents. Anal Chem，1992，64:946-953.