大鼠腦挫傷后細胞間黏附因子1時序性表達的實驗性研究

顧均連 焦 炎 梁新華

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西太原 030001

細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是一種糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族，腦組織中幾乎所有的細胞均有ICAM-1的表達，其中微血管細胞是ICAM-1的靶細胞，顱腦損傷時，會引起一系列的炎癥反應(yīng)，該蛋白常存在于炎癥部位的多種細胞表面，研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，正常腦血管內(nèi)皮細胞中ICAM-1的表達極低，當發(fā)生腦缺血缺氧或者彌漫性腦損傷后其表達上調(diào)，但目前在國內(nèi)外對大鼠腦挫傷中ICAM-1的表達規(guī)律研究很少。本實驗欲通建立大鼠閉合性腦挫傷模型，對大鼠腦挫傷后腦組織中ICAM-1的變化規(guī)律進行觀察，研究其與腦挫傷早期損傷時間的關(guān)系，可以為法醫(yī)學(xué)中早期損傷時間的推斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康成年Wistar大鼠56只（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重250～300 g，雌雄不限，隨機分成陰性對照組和腦挫傷后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d組，共7組，每組8只。

1.2 材料及來源

兔抗大鼠ICAM-1抗體購自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司，生物素標記羊抗兔抗體購自北京康為世紀生物技術(shù)有限公司，組織蛋白抽提試劑盒、蛋白定量試劑盒、發(fā)光劑均購自普利萊因技術(shù)有限公司。

1.3 模型制備和取材

參照Feeney法[3]建立大鼠閉合性腦挫傷，大鼠稱重后，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，褪毛，正中線切開頭部皮膚，分離骨膜，在人字縫前方3 mm，顱骨中線左側(cè)3 mm處，鉆直徑5 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整，用自制的硬性打擊墊放入骨窗，以50 g砝碼在40 cm處落下打擊一次；對照組僅切開頭皮，鉆孔等，不受自由落體物打擊，然后直接處死取出腦組織，實驗組大鼠分別在傷后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d處死，于挫傷部位取出腦組織，然后分別稱取100 g腦組織，放在液氮里密封存。

1.4 方法

本實驗采用Western blot方法對大鼠腦挫傷后不同時間段ICAM-1的表達進行檢測，從液氮中取出稱重好的組織，加入蛋白裂解液，勻漿機中充分快速勻漿，在4℃提取蛋白后備用，加1︰2的樣品緩沖液混勻，沸水浴5 min，取出樣品混合液，對照組用加樣緩沖液代替蛋白質(zhì)樣品，加在8%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離蛋白質(zhì)，然后用半干式電轉(zhuǎn)移法將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用封閉液浸泡，4℃過夜，取出滴加一抗，4℃過夜，用TBST溶液沖洗5 min×4次，滴加生物素標記的羊抗兔抗體，室溫孵育2.5 h，TBST溶液充分淋洗5 min×4次，PBS淋洗10 min×4次，然后發(fā)光顯影，固定[4-7]。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)方法

用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖像進行分析，以條帶積分光密度值（integrate optical density，IOD）作為ICAM-1的相對量。用SPSS 13.0軟件對所得的數(shù)據(jù)進行組內(nèi)和組間的方差分析，統(tǒng)計方法為方差分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡結(jié)果圖像分析結(jié)果

大鼠腦挫傷后1 h可見條帶明顯增寬，到72 h條帶增至最寬，到7 d還可見條帶比陰性對照組略寬（圖1），經(jīng)內(nèi)參β-actin的校正，使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對ICAM-1免疫印跡條帶進行分析，以條帶IOD作為ICAM-1的相對量，可見大鼠腦挫傷后1 h就有少量的ICAM-1表達，24 h后逐漸增多，到72 h達到最高峰，其后下降，傷后7 d仍有表達，且高于對照組水平。見表1。

圖1 大鼠腦挫傷后不同時間段ICAM-1免疫印跡條帶

表1 大鼠腦挫傷后不同時間段ICAM-1的IOD值（±s）

表1 大鼠腦挫傷后不同時間段ICAM-1的IOD值（±s）

組別 只數(shù) IOD值對照組1 h組6 h組24 h組48 h組72 h組7 d組8888888 20861.40±632.103▲53534.22±179.892▲72511.80±660.590▲91988.40±682.893▲131555.2±508.860▲176958.11±1274.026▲41611.38±587.171▲

2.2 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：各實驗組與對照組分別對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而各實驗組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

3 討論

腦挫傷是指頭部外力作用引起的腦組織出血性壞死，這是腦損傷中最常見的一種損傷，也是顱腦損傷中導(dǎo)致死亡的原因之一，研究表明[8]，組織損傷后會引起一系列的炎性反應(yīng)。黏附因子是在炎性反應(yīng)過程中起重要的作用的因子，它是由細胞產(chǎn)生、存在于細胞表面、介導(dǎo)細胞與細胞間或細胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子，主要由3組黏附因子組成，分別是選擇素家族，免疫球蛋白家族，鈣粘蛋白家族，其中起核心作用的是ICAM-1，ICAM-1是免疫球蛋白家族的重要成員，介導(dǎo)多種炎性因子與血管內(nèi)皮細胞的黏附。許多研究表明[9]，顱腦損傷后ICAM-1的表達增多，白細胞與血管內(nèi)皮細胞間黏附力增強，白細胞通過內(nèi)皮細胞間隙可進入周圍腦組織，釋放大量炎性介質(zhì)和細胞因子，其中許多細胞因子可直接或間接調(diào)節(jié)ICAM-1在炎癥反應(yīng)中的表達，使其表達增多，其中包括核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素1β（IL-1β）等多種細胞因子。

本實驗運用Western blot方法對ICAM-1蛋白表達進行觀測，實驗結(jié)果顯示，大鼠腦挫傷后腦組織中ICAM-1蛋白表達在損傷1 h后開始有微量的增多，24 h明顯增多，在72 h到達頂峰，其后下降，7 d后仍有表達，且高于對照組水平，可見其表達有一定的規(guī)律性，分析原因可能為：腦組織挫傷后，ICAM-1在腦血管內(nèi)皮細胞上的表達開始增多，使得白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附力不斷增強，隨著時間的延長，白細胞跨過內(nèi)皮細胞間隙進入周圍組織，釋放多種炎性因子，內(nèi)皮細胞可在多種細胞因子如NF-κB、TNF等刺激下誘導(dǎo)ICAM-1的表達增多，在72 h達到高峰，隨著損傷時間的延長，組織細胞自我修復(fù)，炎性反應(yīng)消退，細胞因子逐漸減少，使得ICAM-1的表達逐漸下降。ICAM-1在腦挫傷過程中隨著時間的延長產(chǎn)生規(guī)律性的變化，可以為法醫(yī)學(xué)中腦挫傷早期損傷時間推斷提供一定的依據(jù)。

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