急性痛風性關節(jié)炎患者治療前后外周血單核細胞NLRP3炎性體mRNA表達及血清IL-1β水平的研究*

丁煥發(fā)王尚云徐曉辰劉淑娟蘭立強韋涌濤

急性痛風性關節(jié)炎患者治療前后外周血單核細胞NLRP3炎性體mRNA表達及血清IL-1β水平的研究*

丁煥發(fā)①王尚云①徐曉辰①劉淑娟①蘭立強①韋涌濤①

【摘要】目的：檢測急性痛風性關節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）患者治療前后外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）中NLRP3炎性體［NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）］mRNA表達水平及血清白介素-1β（IL-1β）水平的變化，探討該炎性體及IL-1β 在AGA發(fā)病中可能的作用機制。方法：用RT-PCR法檢測100名健康查體者（對照組）和100例AGA患者（觀察組）治療前（D0）及應用藥物治療后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）NLRP3炎性體mRNA表達水平，同時用ELISA法測定相應IL-1β水平。比較兩組患者生理指標和血生化指標的差異。結果：觀察組NLRP3 mRNA表達水平D0、D3及D7與對照組比較均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；觀察組各階段ASC mRNA表達水平與對照組比較均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組caspase-1 mRNA表達水平，D0和D3與對照組比較均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。觀察組血清IL-1β水平在D0、D3、D7與對照組比較均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：NLRP3炎性體及IL-1β在AGA患者治療過程中水平異常，提示其在AGA發(fā)病中參與了炎癥反應過程，在炎癥機制中可能發(fā)揮了重要作用。

【關鍵詞】凋亡相關斑點樣蛋白； 半胱天冬酶-1； NLRP3； 炎性體； 痛風性關節(jié)炎

First-author’s adress：Qingdao Eighth People’s Hospital，Qingdao 266100，China

隨著社會的發(fā)展，人們的生活水平、飲食結構及社交行為方式發(fā)生了很大的改變，同時人類壽命也在延長，痛風的患病率逐年上升，急性痛風性關節(jié)炎（AGA）患病率隨年齡的增長有逐漸增高的趨勢，且常伴有糖尿病、肥胖、心腦血管病、腎臟病等，發(fā)病高峰年齡為40歲左右，臨床上以男性患者多見，女性約占5%［1］，且多為絕經(jīng)期后婦女。近年來研究發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細胞系統(tǒng)在AGA啟動、進展及緩解中均發(fā)揮了關鍵作用，其中IL-1β是單鈉尿酸鹽（MSU）晶體誘導炎癥的關鍵因子，NLRP3炎性體通過促進IL-1β的生成在AGA發(fā)作中發(fā)揮不可替代的作用［2］。本研究即對此進行研究、探討，以期發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體及IL-1β在AGA啟動、進展及緩解的各個階段表達水平的變化及意義，指導AGA的早期防治及優(yōu)化治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 觀察組：選取2014年8月-2016年2月本院門診患者100例，男95例，女5例，年齡（47.25±10.99）歲，均符合以下診斷標準和剔除標準，（1）急性痛風性關節(jié)炎診斷標準：應用美國風濕病協(xié)會（ACR）1997年制定的診斷標準。（2）入選和排除標準：①符合ACR診斷標準的急性原發(fā)性痛風性關節(jié)炎；②排除心血管、腎臟、血液疾病、腫瘤疾病引起的繼發(fā)性痛風；③排除合并感染性疾病患者；④排除自身免疫性疾病及全身系統(tǒng)疾病患者；⑤年齡18～75歲；⑥一般情況良好；⑦未服用降尿酸藥物治療者。對照組：隨機選取青島本地居民健康查體者100例，男95例，女5例，年齡（46.15±11.80）歲，排除高尿酸血癥患者。高尿酸血癥的診斷標準：在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日兩次空腹血清尿酸水平（37 ℃）男性＞420 μmol/L，絕經(jīng)前女性＞360 μmol/L，絕經(jīng)后女性的診斷標準同男性。本研究得到本院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。兩組研究對象的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治療方法 AGA發(fā)病時的一線鎮(zhèn)痛藥物包括非甾體類消炎藥（NSAIDs）、COX-2抑制劑、秋水仙堿或類固醇藥物，首選秋水仙堿及NSAIDs，通過降低患者血清及關節(jié)液中IL-1β、TNF-α、環(huán)氧化酶-2等的水平發(fā)揮作用［3-5］。治療方案：在低嘌呤飲食、足量飲水前提下，進行如下治療，（1）鎮(zhèn)痛：為主要治療措施。秋水仙堿片，服藥療程14 d：前3 d 0.5 mg/次，3次/d，餐后服；后0.5 mg/次，2次/d，餐后服，連續(xù)用藥7 d；后4 d 0.5 mg/次，1次/晚，睡前服。依托考昔片，服藥療程10 d：前3 d 120 mg/次，1次/d，餐后服；3 d 后60 mg/次，1次/d，餐后服，連續(xù)用藥7 d［6-9］。（2）堿化尿液：抑制尿酸在腎臟形成晶體，促進尿酸腎臟排泄。尿pH值維持在6.2～6.8。口服枸櫞酸鉀鈉顆粒（逍適檸）2.5 g/次，4次/d（三餐后及睡前）。治療中若出現(xiàn)肝、腎功能異常及胃腸道反應則予以排除。

1.3 觀察指標

1.3.1 測定兩組一般生理指標 年齡（Age）、身高（BH）、體重（BW）、收縮壓/舒張壓（SBP/DBP）、腰圍（WC）、臀圍（HC）。計算腰臀比（WHR）及體質量指數(shù)（BMI）。BMI=體重（kg）/身高（m）2。

1.3.2 測定兩組血生化指標 空腹血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、C-反應蛋白（CRP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）；測定兩組全血白細胞總數(shù)（WBC）、中性粒細胞數(shù)（NEUT）、中性粒細胞百分比（NEUT%）。

1.3.3 測定兩組NLRP3炎性體mRNA和血清IL-1β水平 觀察組治療前（第0天，D0）及治療后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA及 caspase-1 mRNA。測定相應時間點的空腹血清IL-1β水平。同時測定對照組上述指標，與觀察組治療前進行比較。

1.4 檢測方法 所有入選者由專人進行一般生理指標測量并記錄。實驗中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Cr、BUN的檢測用全自動生化分析儀，IL-1β的檢測采用ELISA試劑盒。PBMCs中NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA采用RT-PCR檢測。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自動血液分析儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 本研究采用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件包對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料及生化指標比較 兩組性別、年齡、AST比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，觀察組BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、C-RP、WBC、NEUT、NEUT%均明顯升高，HDL-C降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組NLRP3炎性體mRNA水平比較 觀察組NLRP3 mRNA表達水平D0、D3及D7與對照組比較均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），D14與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；觀察組各階段ASC mRNA表達水平與對照組比較均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組caspase-1 mRNA表達水平，D0及D3與對照組比較均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），D7及D14與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組一般資料及生化指標比較（±s）

表1 兩組一般資料及生化指標比較（±s）

組別 性別 例 年齡（歲）BH （cm）BW （kg）BMI （kg/m2）SBP （mm Hg）DBP （mm Hg）WC （cm）男女觀察組（n=100） 95 5 47.25±10.99 171.97±5.61*79.76±11.01*26.87±3.54*138.96±14.90*88.24±11.22*96.77±8.29*對照組（n=100） 95 5 46.15±11.80 162.82±6.34 65.08±9.71 24.48±2.87 132.61±16.74 83.65±8.95 87.10±8.90

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 兩組NLRP3炎性體 mRNA水平比較（±s）

表2 兩組NLRP3炎性體 mRNA水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.01，△P＜0.05

組別 時間 ASC mRNA csapase -1 mRNA NLRP3 mRNA觀察組（n=100）D0 0.028±0.016*0.047±0.030*0.077±0.039*D3 0.030±0.020*0.052±0.030*0.086±0.046*D7 0.017±0.012*0.113±0.057 0.103±0.054*D14 0.013±0.007△0.124±0.066 0.123±0.078對照組（n=100） 0.011±0.006 0.119±0.061 0.130±0.070

2.3 兩組IL-1β水平比較 觀察組血清IL-1β 水 平 在D0、D3、D7分 別 為（62.41±13.68）、（51.34±12.10）、（24.62±5.51）pg/mL，與對照組的（15.56±4.02）pg/mL比較均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；D14為（16.39±3.29）pg/mL與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

痛風是因嘌呤代謝障礙和/或尿酸排泄減少、血UA持續(xù)升高而導致MSU晶體析出并沉積于組織或器官引起的一組臨床癥候群，屬于代謝性風濕?。?0］。報道顯示，國內痛風的患病率目前在1%～3%，2009年山東沿海地區(qū)當?shù)鼐用裢达L患病率為1.96%，2007-2008年美國痛風患病率上升至3.9%［11］。急性痛風性關節(jié)炎（AGA）可發(fā)生于任何年齡，發(fā)病高峰年齡為40歲左右，且常伴有糖尿病、肥胖、心腦血管病、腎臟病等，患病率隨年齡的增長有逐漸增高的趨勢。本研究中，與對照組相比，觀察組BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、均明顯升高，HDL-C降低（P＜0.01），亦支持上述觀點。AGA臨床上以男性患者多見，女性約占5%［1］，且多為絕經(jīng)期后婦女。AGA發(fā)作時疼痛劇烈，患者異常痛苦，嚴重影響日常工作和生活。近年來研究發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細胞系統(tǒng)在AGA啟動、進展及緩解中均發(fā)揮了關鍵作用，其中IL-1β是MSU晶體誘導炎癥的關鍵因子，NLRP3炎性體通過促進IL-1β的生成在痛風發(fā)作中發(fā)揮不可替代的作用。

NLRP3炎性體，即Nod樣受體蛋白3（Nodlike receptor protein 3，NLRP3）炎性體是位于細胞內的一種蛋白質復合體，主要功能為活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）以間接調控IL-1β、IL-18、和IL-33等的成熟和分泌，具有調控機體炎癥反應的功能［12］。NLRP3炎性體是由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族成員NLRP3（NLR family，pyrin domain containing 3）、 凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1）組成的復合體，是內源性或外源性危險信號的胞質內感受器，是活化caspase-1的分子平臺，調控IL-1β和白介素18（IL-18）等促炎細胞因子的成熟和分泌。IL-1β是一個經(jīng)典的促炎性細胞因子，活化的IL-1β與靶細胞上的IL-1受體結合，激活IL-1信號通路和髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）依賴的NF-κB通路，促進IL-1等促炎因子轉錄，誘導機體炎癥反應。IL-1β是促進多種代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要炎癥因子，阻斷其生物學效應能有效緩解代謝性疾病的進展。NLRP3是模式識別胞內受體Nod樣受體蛋白家族的成員，廣泛表達于樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞，具有識別病原體的功能。ASC是NLRP3炎性體的雙重銜接蛋白，能夠以某種橋梁的形式將NLRP3和caspase-1前體連接起來，最終形成具有酶活性的異二聚體caspase-1。caspase-1作為炎性體的效應蛋白，能夠將無活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟的IL-18和IL-1β，促進其成熟分泌。

目前研究認為，NLRP3炎性體是MSU 導致痛風的核心機制。Martinon等［13］研究顯示，NLRP3介導MSU誘導痛風發(fā)生發(fā)展，其機制可能與MSU誘導K+外流有關，還可能與線粒體來源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放有關，溶酶體破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小體的機制之一。本研究結果顯示，AGA發(fā)病時及治療后第3天，ASC mRNA表達水平均高于對照組（P＜0.05）；NLRP3 mRNA及caspase-1 mRNA表達水平均低于對照組（P＜0.01），說明在炎癥早期，NLRP3炎性體參與了疾病過程。治療后第7天，患者NLRP3 mRNA表達水平仍低于對照組（P＜0.01），ASC mRNA表達水平仍高于對照組（P＜0.01），caspase-1 mRNA表達水平與對照組無明顯差異，提示在炎癥持續(xù)存在期間，NLRP3炎性體持續(xù)參與炎癥過程，隨病程進行，炎癥消退過程中，抑制炎癥的調控因素可能逐漸出現(xiàn)。治療第14天ASC mRNA表達水平仍高于對照組（P＜0.05），較前已明顯降低，NLRP3 mRNA及caspase-1 mRNA表達水平與對照組無明顯差異，結果顯示AGA炎癥消退，趨于正常，ASC表達可能存在其他途徑及意義。

AGA的前炎癥介質來源于常駐的滑膜細胞和遷移的單核巨噬細胞，而NEUT的侵入和活化是最重要的環(huán)節(jié)。發(fā)病時關節(jié)滑液和滑膜中出現(xiàn)的大量NEUT甚至可與急性化膿性關節(jié)炎時相當［14］。本研究中，發(fā)病時的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均顯著高于對照組，提示AGA發(fā)病時WBC及NEUT在炎癥初期就參與了反應。

IL-1β已被確定為MSU晶體誘導炎癥的關鍵因子，其變化與痛風的發(fā)作及預后密切相關［15］。研究發(fā)現(xiàn)，AGA患者發(fā)病時血清及關節(jié)積液中IL-1β水平等顯著升高［16-17］。IL-1β對細胞和組織有多種作用。IL-1β是IL-1可溶型。IL-1主要由單核巨噬細胞所產(chǎn)生，也能由中性粒 細胞合成，分為膜結合型（IL-α）和可溶型（IL-β）兩種。IL-1多存在于血液和組織中。其生物學活性包括活化巨噬細胞、粒細胞并增強其活性；刺激單核/巨噬細胞等合成IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α；致炎癥反應等。IL-1β在滑膜、滑液、軟骨等關節(jié)組織中均有它的活性形式被發(fā)現(xiàn)，并被認為是最經(jīng)典的炎癥調節(jié)劑，是炎癥調節(jié)的始動因素。AGA時，MSU及UA激活NLRP3炎性體，上調IL-β表達，促進AGA患者炎癥反應發(fā)生、進展［18-19］。本研究結果中發(fā)現(xiàn)，觀察組血清IL-1β水平在AGA發(fā)病時、治療后第3天、治療后第7天均高于對照組（P＜0.01），治療后第14天無明顯差異（P＞0.05），提示IL-1β在炎癥發(fā)生、進展階段表達加速，隨著病情好轉，炎癥緩解、消退而表達減少，提示IL-1β在AGA發(fā)病機制中發(fā)揮及其重要的作用［20］。

總之，本研究結果表明，NLRP3炎性體及IL-1β在AGA患者發(fā)病及治療過程中水平異常，提示其在AGA發(fā)病中參與了炎癥反應過程，在炎癥機制中可能發(fā)揮了重要作用。結果亦提示，NLRP3炎性體及IL-1β在炎癥過程中存在負向調節(jié)，其在炎癥發(fā)生、進展及緩解中的負面作用亦可能存在，需要在今后的研究中進一步探討。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.002

收稿日期：（2016-06-02） （本文編輯：蔡元元）

*基金項目：青島市衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2014-WJZD103）①山東省青島市第八人民醫(yī)院 山東 青島 266100

通信作者：丁煥發(fā)

Expression of NLRP3 Inflammasome mRNA in PBMCs and Serum Level of IL-1β of Patients with Acute Gouty Arthritis in the Course of Disease Process

DING Huan-fa，WANG Shang-yun，XU Xiao-chen，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：005-009

【Abstract】Objective：To study the expression level of NLRP3 （NLR family，pyrin domain containing 3）inflammasome （NLRP3，ASC，caspase-1） mRNA in peripheral blood monocytes （PBMCs） and serum level of interleukin-1β （IL-1β） of patients with acute gouty arthritis （AGA） in the course of it，and the roles of them in pathogenesis in AGA.Method：NLRP3 inflammasome mRNA was measured using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） in PBMCs.The expression of NLRP3 inflammasome mRNA in PBMCs was compared between patients with AGA（T，n=100 ） and healthy controls（C，n=100）.T consisted of four stages of disease process：pretherapy （D0），the 3rdday after medications（D3），the 7thday after medications（D7） and the 14thday after medications（D14）.IL-1β was measured accordingly using Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） in the two groups.The differences of two group’s observation indexs were compared.The statistical data were analyzed by IBM SPSS 19.0 software.Result：The expression of NLRP3 mRNA in D0，D3 and D7 reduced significantly when compared to C（P＜0.01）.The expression of ASC mRNA in AGA increased significantly when compared to C（P＜0.05）.The expression of caspase-1 mRNA in D0 and D3 reduced significantly when compared to C（P＜0.01）.Serum level of IL-1β in D0，D3 and D7 increased significantly when compared to C（P＜0.01）.Conclusion：Dysregulated expression of the NLRP3 inflammasome and IL-1β level are involved in the inflammatory response and play key roles in the pathogenesis of the process of AGA.

【Key words】Apoptosis-associated speck-like protein； Caspase-1； NLRP3； Inflammasome；Acute gouty arthritis