體外產氣法評定植酸酶對稻糠、玉米麩和麥麩瘤胃發(fā)酵特性的影響

沈莎莎 楊紅建 任清長 白薩茹拉 張曉明

(中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

植酸酶(phytase)即六磷酸肌醇水解酶(myoinositol hexakisphosphate phosphohydrolase)，是通過水解植酸的磷酸單酯鍵生成低級磷酸肌醇和無機磷的一類酶的總稱［1］。目前，植酸酶作為一種新型的飼料添加劑，通常添加到單胃動物或魚類的飼糧中用來降解植物性飼料中的抗營養(yǎng)因子——植酸，并釋放出無機磷以及與植酸結合的蛋白質、微量元素等，進而提高飼料磷利用效率和動物生長性能。與單胃動物不同，反芻動物能很大程度上依靠瘤胃微生物分泌的內源性植酸酶來消化利用飼料中的植酸［1］。由于在反芻動物特別是高產奶牛飼糧中富含植酸磷的谷物飼料所占比例很大，盲目額外添加磷酸氫鈣等無機磷所帶來的奶牛養(yǎng)殖磷排放環(huán)境污染問題備受關注。有研究認為在飼糧中額外添加少量的植酸酶可以提高反芻動物對飼料植酸磷的利用率［2］。但也有文獻研究認為，瘤胃微生物在降解利用富含纖維飼料的同時可以依靠自身分泌的植酸酶來降解利用飼料中的植酸磷，從而可能無需在飼糧中額外添加植酸酶［3］。因此，作者采用短期人工瘤胃發(fā)酵試驗結合動態(tài)產氣實時記錄技術，分析了添加植酸酶對瘤胃微生物降解和利用稻糠、玉米麩和麥麩的功效，以期為今后通過開展飼養(yǎng)試驗開發(fā)和研究植酸酶作為反芻動物飼料添加劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵底物

本試驗采集不同產地的糠麩飼料作為試驗材料，對稻糠分別編號為RB1、RB2、RB3，玉米麩分別編號為 MB1、MB2、MB3，麥麩分別編號為WB1、WB2、WB3。飼料經電熱鼓風干燥箱65℃烘干48 h后粉碎過40目篩。并按實驗室常規(guī)方法［4］對試驗飼料進行粗蛋白質(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和植酸磷含量的測定。

1.2 植酸酶處理方法

植酸酶樣品由中國農業(yè)科學院飼料研究所贈送，活性為5 000 U/g(1 U代表該植酸酶在反應條件下作用于植酸鈉溶液，每分鐘可釋放出1μmol無機磷)。參照Engelen等［5］的酶處理方法，稱取0.5 g植酸酶溶解于100 mL乙酸緩沖液(稱取1.76 g乙酸、30.02 g 三水乙酸鈉、0.147 g 二水氯化鈣溶解于900 mL蒸餾水中，用乙酸調節(jié)pH至5.50，并用蒸餾水定容至1 000 mL)，常溫下在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成25 U/mL植酸酶工作液。

1.3 體外發(fā)酵

使用本實驗室自主開發(fā)和設計的64通路AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵產氣自動記錄裝置和軟件系統(tǒng)［6］進行實時測定累積產氣量。

試驗前，根據Menke等［7］的配方配制緩沖液，主要包括微量元素溶液、碳酸緩沖溶液、磷酸緩沖溶液、硫化鈉(Na2S)還原溶液以及刃天青指示劑。配制好的緩沖液混勻后持續(xù)通入CO230 min以上直至溶液pH達到6.8，置于39℃恒溫水浴鍋中備用。

稱取500 mg待測飼料于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，每種飼料設置對照組和加酶組。對照組設置3個平行，加酶組設置4個平行。于晨飼前1 h內采集3頭安裝有永久瘤胃瘺管、平均日產奶量為20 kg的泌乳期成年荷斯坦奶牛的瘤胃液，等體積混勻后經4層紗布過濾，濾液置于39℃恒溫水浴鍋中，持續(xù)通入CO2備用。

用移液器準確移取50 mL緩沖液和25 mL瘤胃液于各發(fā)酵瓶中，并用微量移液器將100μL配制好的植酸酶工作液添加至加酶組發(fā)酵瓶中，通入CO2數(shù)秒，驅除液面上方空氣后蓋上瓶塞，立即與AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵產氣自動記錄裝置各氣路通道相連，并于39℃條件下連續(xù)培養(yǎng)72 h，期間每12 h輕輕晃動培養(yǎng)基。

1.4 樣品收集與處理

連續(xù)發(fā)酵72 h后，關閉發(fā)酵產氣記錄系統(tǒng)，打開發(fā)酵瓶測定pH。將瓶內發(fā)酵液倒入經烘干稱重的尼龍袋(孔徑200目)中過濾，采集濾液樣品。尼龍袋連同發(fā)酵剩余底物用蒸餾水漂洗后，在65℃下烘干至少48 h后稱重，根據發(fā)酵前飼料樣中的干物質含量，利用差減法計算待測飼料體外發(fā)酵干物質消失率(dry matter disappearance in vitro，IVDMD)。取1.0 mL發(fā)酵濾液在4℃條件下3 000×g離心5 min，收集上清液。取500μL上清液加入150μL 25%(質量體積比)偏磷酸，混勻，4℃靜置30 min后在10 000×g離心15 min，取上清液待分析。

1.5 產氣動力學模型分析

根據AGRS-Ⅲ裝置自動記錄到的各發(fā)酵瓶的產氣時間和對應的累積產氣量，參照?rskov等［8］提出的指數(shù)函數(shù)模型對不同飼料累積產氣量數(shù)據進行非線性擬合，得出:

式中:GPt為累積產氣量(mL/g，干物質基礎)，c為產氣速率(mL/h)，t為產氣時間(h)，lag為產氣延滯時間(h)，A為發(fā)酵底物在該產氣速率下的理論最大產氣量(mL)。

根據下式計算達到最大產氣量1/2時的產氣速率:

式中:AGPR為達到最大產氣量1/2時的產氣速率(mL/h)。

1.6 氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測定

發(fā)酵液中氨態(tài)氮濃度的測定采用靛酚比色法［9］。VFA 含量的測定參照楊紅建等［10］的方法。非糖異生類短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸)與糖異生類短鏈脂肪酸(丙酸、戊酸等)的比率按下式計算:非糖與糖異生的類短鏈脂肪酸比率(NGR)=(乙酸 +2×丁酸 +戊酸)/(丙酸 +戊酸)［11］。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用Excel 2003整理后，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件中GLM 過程進行方差分析，采用Duncan氏法和MEANS語句統(tǒng)計組間差異的顯著性，并利用LSMENAS語句統(tǒng)計各測定指標最小二乘法均值的標準誤(SEM)。差異性顯著水平為P ＜0.050 0，差異極顯著水平為 P ＜0.000 1。

2 結果

2.1 試驗發(fā)酵底物的常規(guī)營養(yǎng)成分

由表1可知，不同來源的同種糠麩飼料營養(yǎng)成分存在較大差異，其中，稻糠中RB1的CP、植酸磷的含量均高于RB2、RB3，其 NDF和ADF的含量最低;麥麩中WB1也存在同樣的特性;玉米麩中MB1的CP和植酸磷的含量最高，NDF含量最低，ADF含量在3中飼料中居中。此外，稻糠、玉米麩和麥麩的營養(yǎng)成分也不同。稻糠的CP含量最低，但其NDF和ADF的含量均高于玉米麩和麥麩。

表1 試驗發(fā)酵底物的常規(guī)營養(yǎng)成分(干物質基礎)Table 1 Common nutrient composition of the experimental fermentation substrates(DM basis) %

2.2 添加植酸酶對3種糠麩飼料體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可知，玉米麩對照組的IVDMD顯著高于加酶組(P＜0.050 0)，而稻糠和麥麩對照組的IVDMD和加酶組差異均不顯著(P＞0.050 0)。飼料種類對IVDMD有極顯著影響(P＜0.000 1)，比較3種糠麩飼料發(fā)現(xiàn)，它們的IVDMD表現(xiàn)為玉米麩＞麥麩＞稻糠。而就植酸酶添加效果而言，添加5 U/g的植酸酶并不能顯著改變飼料IVDMD(P ＞0.050 0)。

除稻糠加酶組產氣速率顯著低于對照組外(P＜0.050 0)，同一飼料各發(fā)酵動力學參數(shù)，對照組和加酶組的間均無顯著差異(P＞0.050 0)。比較稻糠、玉米麩和麥麩發(fā)現(xiàn)，飼料種類不同，72 h累積產氣量、理論最大產氣量及達到最大產氣量1/2時的產氣速率存在極顯著差異(P＜0.000 1)，產氣速率和產氣延滯時間存在顯著差異(P＜0.050 0)。此外，比較植酸酶的添加對飼料發(fā)酵動力學參數(shù)的影響發(fā)現(xiàn)，添加5 U/g植酸酶顯著降低了飼料產氣速率及達到最大產氣量1/2時的產氣速率(P＜0.050 0)。不同飼料及酶處理的累積產氣量動態(tài)有明顯的不同，總體上保持玉米麩＞稻糠＞麥麩(圖1)。

2.3 添加植酸酶對3種糠麩體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

由表3可知，對同一飼料而言，對照組和加酶組pH、NH3-N濃度、VFA含量(除異丁酸外)和NGR均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.050 0)。植酸酶顯著提高了總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度(P＜0.050 0)，且TVFA濃度增幅由高至低依次為麥麩(4.2%)、稻糠(3.3%)、玉米麩(1.7%);從VFA含量來看，植酸酶顯著提高了異丁酸含量(P＜0.050 0)，異戊酸和戊酸的含量有提高的趨勢，但差異不顯著(P＞0.050 0)。此外，添加植酸酶也不能顯著改變NGR(P＞0.050 0)。

比較稻糠、玉米麩和麥麩3種飼料發(fā)現(xiàn)，各種VFA的含量不同飼料間存在較大的差異。丁酸和異戊酸含量飼料間不存在顯著差異(P＞0.050 0)，飼料種類不同，異丁酸含量存在顯著差異(P＜0.050 0)，乙酸、丙酸和戊酸含量均存在極顯著差異(P＜0.000 1)。乙酸含量稻糠＞麥麩＞玉米麩，丙酸和戊酸的含量均為玉米麩＞麥麩＞稻糠。

3 討論

飼料有機物的消化率與體外培養(yǎng)的產氣量之間存在較高的相關性，即產氣量越高，飼料在瘤胃內的發(fā)酵程度越高［12］。本試驗以稻糠、玉米麩和麥麩為發(fā)酵底物，采用短期人工瘤胃發(fā)酵試驗結合動態(tài)產氣實時記錄技術，發(fā)現(xiàn)3種糠麩飼料微生物消化率表現(xiàn)為玉米麩 ＞麥麩 ＞稻糠，符合Nsahlai等［13］研究指出的理論最大產氣量與飼料本身NDF含量呈顯著負相關，與CP含量呈正相關的規(guī)律。但額外添加植酸酶除可顯著降低產氣速率外，并未顯著影響飼料體外發(fā)酵累積產氣量和理論最大產氣量。目前，國內外有關額外添加植酸酶對體外發(fā)酵產氣量影響未見報道，研究多集中添加植酸酶提高飼料植酸磷的降解利用效率上。Kincaid等［2］發(fā)現(xiàn)在奶牛全混合日糧中額外添加427 U/kg植酸酶能明顯提高飼料植酸磷的降解和總磷的利用率，但奶牛的干物質采食量和產奶效率均不受植酸酶的影響。Bravo等［14］在泌乳山羊和干奶期奶牛飼糧中額外添加真菌植酸酶(2 000 IU)，并利用尼龍袋技術研究豆粕和菜籽粕的干物質降解率和磷在瘤胃中的降解率時指出，添加真菌植酸酶有降低豆粕干物質降解率的趨勢，但對菜籽粕的干物質降解率沒有影響。本試驗通過比較對照組和加酶組IVDMD發(fā)現(xiàn)，在稻糠、玉米麩和麥麩中額外添加5 U/g植酸酶有降低其IVDMD的趨勢，且玉米麩IVDMD的變化最顯著，與 Bravo 等［14］結果相似。

表2 植酸酶對糠麩飼料體外發(fā)酵72 h干物質消失率、產氣量及發(fā)酵動力學參數(shù)的影響Table 2 Effects of phytase on IVDMD，gas production and fermentation kinetic parameters of grain brans after fermented for 72 h

圖1 體外發(fā)酵累積產氣量動態(tài)曲線Fig.1 The dynamic curve of accumulative gas production of fermentation in vitro

飼料在瘤胃微生物的作用下可產生大量的乙酸、丙酸及丁酸等VFA，它們是反芻動物的主要能量來源，可提供反芻動物總能量需要量的70%～80%［15］。本試驗通過測定發(fā)酵液中的各種 VFA含量發(fā)現(xiàn)，雖然與對照組相比，額外添加植酸酶并未顯著影響3種糠麩飼料發(fā)酵產生的乙酸、丙酸和丁酸含量，但從整體來看，乙酸的含量較高，為66.42% ～71.10%;丙酸含量偏低，為 12.26% ～16.35%;丁酸含量也在10%左右。額外添加植酸酶卻顯著增加了異丁酸的含量，同時也顯著提高了飼料發(fā)酵后TVFA濃度。該結果與Bravo等［14］的結果稍有不同，該研究通過測定乙酸、丙酸和丁酸3種主要的短鏈VFA含量指出，在泌乳山羊飼糧中額外添加真菌植酸酶并不能顯著影響乙酸含量和乙酸/丙酸，卻顯著提高了丙酸的含量(從23.4%提高至28.4%)以及顯著降低了丁酸的含量(從16.3%降低至12.4%)，不過這種 VFA含量的變化可能是因為在泌乳山羊飼糧中添加了70%的精料。戊酸、異丁酸、異戊酸分別是飼料的蛋白質中纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的微生物發(fā)酵產物［16］，在本試驗中這3種VFA在添加植酸酶后都有不同程度的提高，尤其是異丁酸含量顯著升高，從一定程度上說明添加植酸酶促進了瘤胃微生物對飼料中上述3種氨基酸的代謝，在后續(xù)的研究中應注意瘤胃微生物蛋白質合成量的測定。此外，本試驗根據測得的乙酸、丙酸、丁酸及戊酸含量計算得出的NGR與Zhang等［17］用羊草∶玉米為4∶1的混合飼料底物進行體外瘤胃發(fā)酵48 h后測得的未添加任何甲烷抑制劑的對照組NGR(3.83)相比結果偏高，但與 Yang等［18］利用不同碳源和氮源組合的培養(yǎng)基研究新麗鞭毛菌(Neocallimastix sp.YQ1)以苜蓿作為木質纖維性底物時的纖維降解活性試驗中測得的 NGR(4.9～6.5)相近。本試驗結果表明糠麩飼料在瘤胃微生物發(fā)酵作用下生糖前體物——丙酸含量較低，而非生糖前體物或乳脂前體物——乙酸和丁酸含量較高。

表3 植酸酶對糠麩飼料體外瘤胃發(fā)酵特性的影響Table 3 Effects of phytase on rumen fermentation characteristics of grain brans in vitro

4 結論

稻糠、玉米麩和麥麩間體外瘤胃發(fā)酵特性存在差異，添加5 U/g植酸酶可在一定程度上促進瘤胃微生物發(fā)酵釋放出更多的VFA，提高瘤胃微生物對飼料中能量物質的發(fā)酵利用效率。

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