熒光原位雜交檢測宮頸細(xì)胞hTERC基因擴(kuò)增及其臨床意義

鐘守軍 劉曉萍 米賢軍 段立鋒 楊偉洪 陳志強(qiáng)

廣東省中山市博愛醫(yī)院病理科，廣東中山 528403

宮頸癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤，是一個(gè)從宮頸CIN（CIN1→CIN2→CIN3）→早期浸潤癌→浸潤癌、由量變到質(zhì)變的連續(xù)發(fā)展過程。腫瘤從根本上說是一類基因病，而染色體的異常則是各種腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。目前對(duì)宮頸癌遺傳不穩(wěn)定性的分析研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長臂的擴(kuò)增，其中涉及到最重要的基因可能是端粒酶基因（hTERC）[1]。FISH是一種可以有效識(shí)別染色體畸變的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，能夠提高細(xì)胞學(xué)的診斷效率與準(zhǔn)確性[2]。本研究應(yīng)用FISH檢測不同病變類型的宮頸脫落細(xì)胞中hTERC基因的擴(kuò)增情況，探討其與宮頸CIN及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為臨床宮頸癌及癌前病變的篩查、早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本

收集筆者所在醫(yī)院2008年3～12月行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測的異常細(xì)胞學(xué)標(biāo)本100例，患者年齡19～63歲，平均（41.3±1.5）歲，其中CIN 80例（CIN1 30例、CIN2 31例、CIN3和原位癌19例），浸潤性鱗狀細(xì)胞癌20例。所有100例異常細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果均經(jīng)電子陰道鏡下病理活組織檢查診斷證實(shí)。另取同期在院體驗(yàn)的健康女性20例，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果正常，未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變（NILM）,建立正常閾值。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本采集 用細(xì)胞學(xué)專用宮頸刷在宮頸鱗柱交界處，以外口為中心，均勻旋轉(zhuǎn)3～5周，取出宮頸刷洗入裝有ThinPrip保存液的瓶中，經(jīng)系統(tǒng)處理和過濾，細(xì)胞量控制在7萬個(gè)以下，制成均勻的薄層涂片，95%酒精固定，HE染色，經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)診斷醫(yī)師閱片判讀，采用TBS分類標(biāo)準(zhǔn)簽發(fā)細(xì)胞學(xué)報(bào)告。

1.2.2 陰道鏡檢查及病理活檢組織學(xué)診斷 采用德國萊卡公司生產(chǎn)的mZ6型光學(xué)電子陰道鏡檢查評(píng)估。陰道鏡顯示異常圖像如醋酸白色上皮、白斑、異型血管、鑲嵌及碘不著色為陰道鏡結(jié)果陽性，以陰道鏡下病理活檢組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 FISH方法檢測hTERC基因擴(kuò)增 將TCT保存液瓶中剩余的液體，按照FISH檢測的操作說明，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)制片、預(yù)處理、變性、雜交。hTERC探針為hTERC/CSP3 DNA雙色探針，由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供，其中hTERC DNA探針雜交到3號(hào)染色體3q26.3位點(diǎn)，CSP3 DNA探針雜交到3號(hào)染色體著絲粒（3p11.1-q11.1），兩者分別以紅色熒光信號(hào)（四甲基羅丹明）和綠色熒光信號(hào)（細(xì)胞綠）標(biāo)記，用CSP3作為對(duì)照探針。

1.3 結(jié)果判斷

于暗室中用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡在 DAPI/FIFC/Texas Red 三色濾光鏡激發(fā)下觀察細(xì)胞學(xué)涂片中間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)。采用北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供的 FISH圖像分析軟件進(jìn)行分析處理，評(píng)估整個(gè)細(xì)胞學(xué)涂片中間期細(xì)胞的hTERC和CSP3 DNA雙色探針雜交情況。正常單個(gè)間期細(xì)胞分別可見2個(gè)紅色及綠色信號(hào)；若單個(gè)間期細(xì)胞紅色信號(hào)大于2個(gè)，且綠色信號(hào)不少于2個(gè)則為hTERC基因異常擴(kuò)增之細(xì)胞。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)至少需計(jì)數(shù)熒光信號(hào)完整的200個(gè)細(xì)胞，若其中有40個(gè)以上異常細(xì)胞表現(xiàn)為 hTERC基因拷貝數(shù)的增加，即判定為陽性。

1.4 建立閾值

取20例同期宮頸NILM脫落細(xì)胞，用FISH方法進(jìn)行hTERC基因檢測，然后在熒光顯微鏡下隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中紅色信號(hào)數(shù)超過3的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞數(shù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，建立閾值。閾值=（均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差）%，本研究所建閾值為4.33%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本率的比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CIN1組中hTERC基因的擴(kuò)增率為13.3 %；CIN2組中hTERC基因擴(kuò)增率為71.0 %；CIN3組及浸潤性鱗癌組hTERC基因擴(kuò)增率均為100.0%。見表1。其中大部分hTERC基因擴(kuò)增為3倍體或4倍體擴(kuò)增，少部分是5倍體或以上擴(kuò)增。

表1 宮頸癌細(xì)胞病變中hTERC基因擴(kuò)增情況

3 討論

臨床實(shí)踐表明宮頸癌的預(yù)防可以通過早期篩查和早期干預(yù)來實(shí)現(xiàn)。目前常用于宮頸癌及癌前病變篩查的方法有宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV病毒檢測，前者屬于形態(tài)學(xué)的方法，后者則屬于病因?qū)W方面的檢測。由于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的假陰性率較高，且形態(tài)學(xué)的方法診斷主觀性相對(duì)較強(qiáng)；另外，雖然高危型HPV病毒檢測的敏感性較高，但相對(duì)特異性不夠。因此尋找準(zhǔn)確高效的宮頸癌篩查方法以達(dá)到早期診斷、早期干預(yù)的目的，從根本上降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率是多年來人們一直在努力追求的方向。

腫瘤從根本上說是一類基因病，發(fā)生的基礎(chǔ)是由于各種原因所致的原癌基因激活或（和）腫瘤抑制基因失活的結(jié)果，宮頸癌的發(fā)生也是如此。臨床已經(jīng)證實(shí)HPV病毒的感染是導(dǎo)致宮頸CIN及宮頸癌發(fā)生的重要病因?qū)W要素。除了HPV感染，基因等方面的因素在宮頸癌前病變發(fā)展到癌的過程中也起到了十分重要的作用。對(duì)宮頸癌遺傳不穩(wěn)定性的分析研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中最常見的染色體畸變之一是染色體臂3q的畸變，而hTERC基因即定位于染色體3q26.3，該基因的擴(kuò)增可以阻止細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3]。FISH是一種可以有效識(shí)別染色體畸變的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可以提高細(xì)胞學(xué)的診斷效率與準(zhǔn)確性。由于FISH技術(shù)相對(duì)簡單、穩(wěn)定、重復(fù)性好，并且可以不需要細(xì)胞培養(yǎng)而適用于染色體間期細(xì)胞，同時(shí)又具有較高的靈敏性及特異性，是以目前已成為一種常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測手段，在產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳性疾病的診斷及血液腫瘤、實(shí)體瘤等方面的檢測中廣泛應(yīng)用[2]。Heselmeyer-Haddad[4-5]首先將FISH方法用于宮頸細(xì)胞hTERC基因擴(kuò)增的檢測，發(fā)現(xiàn)63%的CIN2中有該基因的擴(kuò)增，而76%的CIN3和原位癌中有該基因擴(kuò)增，且hTERC基因擴(kuò)增率及四倍體細(xì)胞數(shù)隨著細(xì)胞學(xué)病變的嚴(yán)重程度而增加，可以作為預(yù)測宮頸高級(jí)別CIN的獨(dú)立指標(biāo)，并且認(rèn)為特異性的基因組異常改變是宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤性癌所必備的條件之一。另有研究報(bào)道在宮頸腺癌細(xì)胞中也同樣存在hTERC基因的擴(kuò)增，其比例范圍約為2.3～5.2，平均約為3.3，因此認(rèn)為應(yīng)用FISH方法檢測hTERC基因擴(kuò)增可以作為宮頸腺癌篩查的遺傳學(xué)診斷手段[6]。

本研究中應(yīng)用FISH方法檢測了100例各類宮頸病變細(xì)胞中hTERC基因的擴(kuò)增情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各級(jí)別宮頸CIN和宮頸鱗癌細(xì)胞中均存在有hTERC基因不同程度的擴(kuò)增：CIN1組擴(kuò)增率13.3%，CIN2組擴(kuò)增率71.0%，而CIN3組和宮頸鱗癌組均為100%，且hTERC基因擴(kuò)增率隨著宮頸病變的進(jìn)展程度而逐漸增加；高級(jí)別CIN和癌的擴(kuò)增率明顯高于低級(jí)別CIN，與文獻(xiàn)研究報(bào)道結(jié)果一致[7-8]，表明FISH可以作為細(xì)胞學(xué)篩查的輔助手段，對(duì)于宮頸癌前病變的發(fā)現(xiàn)與早期診斷具有極大價(jià)值；另一方面，對(duì)于低級(jí)別宮頸CIN患者，如果檢測存在有hTERC基因擴(kuò)增，則宮頸病變向高級(jí)別CIN或癌進(jìn)展的可能性較大。因此應(yīng)用FISH方法檢測hTERC基因擴(kuò)增不但可以作為宮頸CIN和宮頸癌早期篩查的細(xì)胞遺傳學(xué)手段，而且還可以用于預(yù)測低級(jí)別CIN向高級(jí)別CIN或癌進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。

總之，由于FISH技術(shù)相對(duì)簡單、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可以直接用于檢測宮頸脫落細(xì)胞學(xué)涂片中的間期細(xì)胞，檢測結(jié)果較為客觀準(zhǔn)確，同時(shí)又具有較高的敏感性和特異性，并且與臨床病理診斷及細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果之間的符合率較高，因此FISH技術(shù)可以作為繼宮頸細(xì)胞學(xué)及高危型HPV病毒檢測之后的重要的宮頸癌篩查手段，同時(shí)還可以在一定程度上預(yù)測低級(jí)別CIN向高級(jí)別CIN或癌進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。采用FISH方法檢測宮頸細(xì)胞hTERC基因擴(kuò)增有望成為臨床工作中制定宮頸CIN和宮頸癌篩查措施、指導(dǎo)治療及評(píng)估預(yù)后的重要依據(jù)。

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