紅曲多糖的過(guò)氧化氫法脫色工藝研究*

汪鵬榮， 陳文靜， 韋 鳳， 董夏夢(mèng)， 蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌，系中藥紅曲的基原菌［1］，是一類小型絲狀腐生真菌，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)不整囊菌綱(Plectomycetes)散囊菌目(Eurotiales)紅曲科(Monascaceae)．由于紅曲霉在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生多種具有生理活性的代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、Monacolin類物質(zhì)、紅曲多糖、γ-氨基丁酸及多種酶類，因此紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物也成為研究的焦點(diǎn)．紅曲多糖是從紅曲霉發(fā)酵液和菌絲體中分離出來(lái)的一種活性多糖，具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等多種功能［2-5］．紅曲粗多糖呈黃褐色，顏色較深，對(duì)后續(xù)的分離純化及生物活性的研究有較大的影響．因此，對(duì)紅曲粗多糖進(jìn)行脫色，既可以提高多糖的純度，又有利于對(duì)紅曲多糖活性的研究．

響應(yīng)面分析法(Response Surface Method，RSM)是由Box等于20世紀(jì)50年代提出的一種優(yōu)化工藝條件的有效方法［6］．它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系．響應(yīng)面法已經(jīng)在諸多工藝過(guò)程優(yōu)化中得到應(yīng)用［7］．本研究以過(guò)氧化氫為脫色劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)紅曲多糖的過(guò)氧化氫脫色工藝進(jìn)行了優(yōu)化．

1 材料與方法

1．1 材料

紅色紅曲霉(Monascus rubber)菌株Mr-70由本實(shí)驗(yàn)室自行分離得到．

1．2 培養(yǎng)基

1)種子培養(yǎng)基

參見文獻(xiàn)［8］．組成:葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏 1 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．01 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，水 1 000 mL，pH 6．0．

2)發(fā)酵培養(yǎng)基

參見文獻(xiàn)［9］．蔗糖40 g/L，酵母粉4．5 g/L，KH2PO4·3H2O 3．5 g/L，MgSO4·7H2O 0．4 g/L，發(fā)酵液起始pH 5．0．

1．3 儀器設(shè)備與試劑

C24KC生物恒溫?fù)u床(美國(guó)Certified公司);MIKRO-22R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettichi公司);UV-7504紫外可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器公司);DHG-9101．28A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東鄄城科源儀器設(shè)備廠);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(山東鄄城科源儀器設(shè)備廠);JA3003A天平(上海精天電子儀器有限公司)．

過(guò)氧化氫(3%)和無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純．實(shí)驗(yàn)用水為去離子水．

1．4 紅曲粗多糖的提取

用打孔器(直徑0．8 cm)取30℃培養(yǎng)5 d的紅曲霉菌株Mr-70接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)48 h，再接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以200 r/min，30℃培養(yǎng)96 h．發(fā)酵液抽濾，向?yàn)V液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，在5℃靜置12 h后離心，沉淀用乙醇和丙酮反復(fù)沖洗多次，在80℃烘干12 h至恒重，即得紅曲霉胞外粗多糖．

1．5 脫色率測(cè)定

對(duì)紅曲粗多糖溶液進(jìn)行可見-紫外光全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明無(wú)色素的最大吸收波長(zhǎng)．根據(jù)互補(bǔ)色原理，選擇450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)［10］，并按照公式(1)計(jì)算脫色率:

1．6 單因素實(shí)驗(yàn)

選取過(guò)氧化氫加入量、脫色溫度和脫色時(shí)間3個(gè)影響因素，分別做單因素實(shí)驗(yàn)．具體做法如下:取20 mL的試管，分別加入4 mL紅曲粗多糖提取液，按設(shè)計(jì)要求加入適量的過(guò)氧化氫，在設(shè)定的溫度下震蕩脫色相應(yīng)時(shí)間，測(cè)定脫色前后的吸光度A450，按公式(1)計(jì)算各自的脫色率．

1．7 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇確定過(guò)氧化氫加入量、脫色時(shí)間和脫色溫度的3個(gè)水平，按Box-Behnken方法設(shè)計(jì)3因素3水平的實(shí)驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法對(duì)紅曲多糖的過(guò)氧化氫脫色條件進(jìn)行優(yōu)化．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示．

表1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2．1 過(guò)氧化氫加入量對(duì)脫色效果的影響

用過(guò)氧化氫法脫除紅曲多糖溶液的色素時(shí)，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中分別加入1，2，3，4 和5 mL 3%過(guò)氧化氫溶液，50℃水浴條件下脫色120 min，過(guò)氧化氫的加入量與脫色效果的關(guān)系如圖1所示．

圖1 3%過(guò)氧化氫溶液加入量對(duì)脫色率的影響

由圖1可知，隨著過(guò)氧化氫加入量的增加，紅曲多糖的脫色率逐漸提高．但是，當(dāng)過(guò)氧化氫加入量超過(guò)4 mL后，脫色率增加很緩慢．過(guò)氧化氫加入量從1 mL增加到3 mL時(shí)，脫色率增加了6．92%;從3 mL增加到4 mL時(shí)，脫色率增加了3．16%;而從4 mL增加到5 mL時(shí)，脫色率僅僅增加了0．59%．考慮到成本和降解等因素，選擇3%過(guò)氧化氫溶液的適宜加入量為4 mL．

2．2 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

用過(guò)氧化氫脫除紅曲多糖溶液的色素時(shí)，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中加入4 mL 3%過(guò)氧化氫溶液，50℃水浴條件下設(shè)定脫色時(shí)間分別為30，60，90，120 和 150 min，脫色時(shí)間與脫色效果的關(guān)系如圖2所示．

由圖2可知，隨著脫色時(shí)間的增加，脫色率也隨之增加，但當(dāng)脫色時(shí)間超過(guò)120 min后，脫色率增加很緩慢．考慮到隨著脫色時(shí)間的增加多糖的損失也會(huì)增加，選定120 min為最佳脫色時(shí)間．

2．3 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響

用過(guò)氧化氫脫除紅曲多糖溶液的色素時(shí)，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中加入4 mL 3%過(guò)氧化氫溶液，分別在30，40，50，60和70℃水浴條件下脫色120 min，脫色溫度與脫色效果的關(guān)系如圖3所示．

由圖3可知:溫度對(duì)紅曲多糖脫色率的影響較大，從30℃到40℃，脫色率增加了7．46%;從40℃到60℃，脫色率分別增加了18．67%和9．07%;而從60℃到70℃，脫色率僅僅增加了1．86%，同時(shí)，高溫還容易使多糖降解．因此，選擇60℃為本研究的最適脫色溫度．

2．4 響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲多糖過(guò)氧化氫脫色工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以過(guò)氧化氫加入量、脫色時(shí)間和脫色溫度3個(gè)因素為自變量、紅曲多糖脫色率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在3因素3水平上對(duì)紅曲多糖的脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化．實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1;響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2．

2．4．1 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)每個(gè)因素取3個(gè)水平，以(-1，0，+1)編碼，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值［11］．表2中，12組實(shí)驗(yàn)為析因?qū)嶒?yàn)、3組為中心實(shí)驗(yàn)．15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中:析因點(diǎn)為自變量取值在X1，X2和X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差．

2．4．2 回歸方程的建立與方差分析

利用 Design-Expert(version7，Stat-EaseInc．，MinneapolisN．USA)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到了紅曲多糖脫色率(Y)對(duì)過(guò)氧化氫加入量(X1)、脫色時(shí)間(X2)和脫色溫度(X3)的二次多項(xiàng)式回歸模型:

表3和表4是對(duì)方程(2)的方差和回歸分析結(jié)果．由表 3和表 4可知:FModel=42．92，P=0．000 3 ＜0．01，表明二次多項(xiàng)式回歸模型極顯著;P失擬項(xiàng)=0．115 2 ＞0．05，說(shuō)明模型失擬不顯著;模型的確定系數(shù)R2=0．987 2，表明模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有98．72%的符合度;調(diào)整后的 R2Adj=0．964 2，表明模型有很高的可信度，可以用此模型對(duì)紅曲多糖的過(guò)氧化氫法脫色進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)．其中:模型的一次項(xiàng)X1，X2和X3顯著，單因素對(duì)紅曲多糖脫色率的影響大小順序依次是脫色溫度﹥脫色時(shí)間﹥過(guò)氧化氫加入量;二次項(xiàng)X21，X22和X23顯著;交互項(xiàng)中X1X3和X2X3顯著，X1X2不顯著．

表3 方差分析表

表4 回歸分析表

2．4．3 紅曲多糖脫色率的響應(yīng)面法分析

響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響［12］．根據(jù)回歸模型，利用Design-Expert軟件作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線圖:過(guò)氧化氫加入量和脫色時(shí)間對(duì)紅曲多糖脫色率的影響見圖4;過(guò)氧化氫加入量和脫色溫度對(duì)紅曲多糖脫色率的影響見圖5;脫色時(shí)間和脫色溫度對(duì)紅曲多糖脫色率的影響見圖6．等高線的形狀(圓形或者橢圓形)可以反映出變量之間的相互影響是否顯著，圓形表示兩因素間交互作用不顯著，而橢圓形則顯著［13］．

由圖4可知:當(dāng)脫色時(shí)間較短時(shí)，隨著過(guò)氧化氫加入量的增加，紅曲多糖脫色率先增加、后緩慢下降;而當(dāng)脫色時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，脫色率隨過(guò)氧化氫加入量的增加緩慢升高后開始顯著下降．因此，在脫色時(shí)間較短的情況下，過(guò)氧化氫加入量的增加有利于紅曲多糖脫色率的提高，而在脫色時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)．

由圖5可知:當(dāng)過(guò)氧化氫加入量一定時(shí)，隨著脫色溫度的升高，紅曲多糖脫色率逐漸增加，溫度達(dá)到一定值后，脫色率趨于平緩;當(dāng)脫色溫度一定時(shí)，隨著過(guò)氧化氫加入量的增加，紅曲多糖脫色率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)．

由圖6可知:當(dāng)脫色溫度不變時(shí)，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，紅曲多糖的脫色率逐漸增加，脫色時(shí)間達(dá)到一定值后，脫色率的變化趨于平緩;當(dāng)脫色時(shí)間一定時(shí)，隨著脫色溫度的升高，紅曲多糖的脫色率逐漸增加．表明欲達(dá)到較高的脫色率，提高脫色溫度可縮短脫色時(shí)間．但是，較高的脫色溫度可能會(huì)導(dǎo)致多糖的降解．在較低的脫色溫度下，適當(dāng)延長(zhǎng)脫色時(shí)間有利于紅曲多糖脫色率的增加．

2．4．4 紅曲多糖脫色條件優(yōu)化

通過(guò)軟件分析得到紅曲多糖過(guò)氧化氫脫色法的最佳脫色條件:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過(guò)氧化氫溶液的加入量為3．87 mL、脫色時(shí)間為126．97 min、脫色溫度為65．62℃，在此條件下紅曲多糖脫色率的理論值為87．20%．為驗(yàn)證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述條件對(duì)紅曲多糖進(jìn)行脫色，考慮到實(shí)際操作的便利，將上述工藝參數(shù)修正為:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過(guò)氧化氫溶液加入量為3．9 mL，脫色時(shí)間為127 min，脫色溫度為65．6℃，3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際平均脫色率為86．24%．實(shí)際實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值基本一致．因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化脫色工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，得到的紅曲多糖的脫色條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值．

3 結(jié)論

綜上所述，為了探索用過(guò)氧化氫法脫除紅曲多糖顏色的適宜工藝條件，在過(guò)氧化氫加入量、脫色時(shí)間和脫色溫度3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)，紅曲多糖過(guò)氧化氫法脫色最適宜的條件為:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過(guò)氧化氫溶液的加入量為3．9 mL、脫色時(shí)間為127 min、脫色溫度為65．6℃．在該條件下紅曲多糖的脫色率可達(dá)86．24%，與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的脫色率87．20%十分相近，驗(yàn)證了響應(yīng)面模型對(duì)脫色工藝優(yōu)化結(jié)果預(yù)測(cè)的可靠性．

［1］Kohama Y，Matsumoto S，Mimura T，et al．Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice［J］．Chem Pharm Bull，1987，35(6):2484-2489．

［2］丁紅梅．紅曲多糖抑瘤作用初步研究［J］．菌物研究，2007，5(3):171-173．

［3］蔡琴，沈彬彬，張慧，等．紅曲霉菌胞外多糖提取及抗氧化活性測(cè)定［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010(3):598-600．

［4］曾露燕，趙樹欣，李燚．紅曲霉抑菌成分糖肽類物質(zhì)的分離純化及穩(wěn)定性［J］．天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(4):18-21．

［5］張建峰，昌友權(quán)，陳光，等．紅曲多糖的免疫活性研究［J］．食品科學(xué)，2008，29(2):391-393．

［6］曹新志，金征宇．響應(yīng)曲面法在環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中的應(yīng)用［J］．鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25(1):58-61．

［7］Chandrika L P，F(xiàn)ereidoon S．Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology［J］．Food Chemistry，2005，93(1):47-56．

［8］蔣冬花，后家衡，李杰，等．紅腐乳中高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選［J］．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，30(4):447-452．

［9］李霞姣，夏永軍，王鐵軍，等．紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］．生物加工過(guò)程，2009，7(2):13-17．

［10］楊云，劉福勤，馮衛(wèi)生，等．堿法提取大棗渣多糖及活性炭脫色的工藝研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7):30-32．

［11］呂國(guó)英，張作法，潘慧娟，等．響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基［J］．菌物學(xué)報(bào)，2010，29(1):106-112．

［12］孫萍萍，王頡，孫劍鋒，等．響應(yīng)面法對(duì)縊蟶粗多糖提取工藝的優(yōu)化［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2010，29(4):203-207．

［13］Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al．A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources［J］．Biochemical Engineering Journal，2001，9(1):17-23．