一氧化氮合酶堿基多態(tài)性與缺血性腦血管病的關(guān)系

孟秀君 胥麗霞 林 巧 田 野 任玉峰 侯 華

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110005)

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其致病因素包括環(huán)境因素和遺傳因素兩大方面。遺傳因素在ICVD發(fā)病過程中起著很重要的作用，家系及雙生子研究表明ICVD具有遺傳易感性〔1，2〕，腦卒中個(gè)體有特異性遺傳構(gòu)成傾向〔3〕。近些年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶基因位點(diǎn)上第7外顯子上G298A、啟動(dòng)子-786T＞C和第4內(nèi)含子上4 b/a堿基多態(tài)性與ICVD有關(guān)。本試驗(yàn)探討該基因位點(diǎn)上此三個(gè)基因位點(diǎn)與ICVD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 隨機(jī)選取2011年3月至2011年6月就診于我院的老年ICVD患者共138例為病例組，包括大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死56例和小動(dòng)脈閉塞性腦梗死(腔隙性腦梗死)82例，其分型依據(jù)中國肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗(yàn)(OAST)分型〔4〕，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1995年中華神經(jīng)科學(xué)會(huì)第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)。所有病例均經(jīng)影像學(xué)檢查(頭CT或MRI)證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn):瓣膜性心臟病、房顫、近期心肌梗死、血液病、腫瘤、癲癇、自身免疫性疾病及由炎癥、栓子、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的繼發(fā)性腦卒中。病例組合并腦梗死68例(49.3%)，合并高血壓98例(71.0%)，合并糖尿病29例(21.0%)，合并冠心病35例(25.4%)。對(duì)照組來自研究期間在我院進(jìn)行體檢的健康老年人群，有心、腦血管病或糖尿病病史者均予以排除，按年齡相差＜5歲，性別、民族相同與病例進(jìn)行匹配，共100例。

所有研究對(duì)象均為漢族，彼此間無血緣關(guān)系。在本人知情同意情況下，對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查問卷來獲取人口學(xué)特征和已知的危險(xiǎn)因素，包括種族、年齡、性別、疾病史、吸煙、飲酒等。病例組與對(duì)照組研究對(duì)象的一般臨床資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 受檢者空腹12～15 h，于次日晨8時(shí)采外周靜脈血10 ml分裝3個(gè)管，2個(gè)管加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)進(jìn)行血常規(guī)測定(2 ml)和生化測定(4 ml)，1管用于DNA提取(4 ml)。血生化檢測指標(biāo)包括肝功能、腎功能、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。所有檢測均采用國際通用方法和標(biāo)準(zhǔn)試劑，在我院檢驗(yàn)科完成。血液樣本在4℃條件下保存。

1.2.2 DNA的提取 采用快速氯仿異戊醇法提取DNA(采用天根DP318-03公司提供的微量DNA提取試劑盒)，提取的DNA樣品分裝后放于-20℃保存。

1.2.3 引物 eNOS基因位點(diǎn)G298A的引物:正向:5'-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3';反向:5'-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3'。-786T＞C的引物:正向:5'-CAC CCA GGC CCA CCC CAA CT-3';反向:5'-GCC GCA GGT CGA CAG AGA GAC T-3'。4 b/a的引物:正向:5'-CTA TGG TAG TGC CTT GGC TGG AGG-3';反向:5'-ACC GCC CAG GGA ACT CCG CT-3'。

1.2.4 PCR-RFLP法檢測基因型 20 μl PCR體系中，含有0.1 μg基因組 DNA 模板，2 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 引物，200 μmol/LdNTP，以及0.5 U Taq酶。2×Taq PCR Master Mix購買自寶生物D512A。E298D和4b/a的PCR條件為:95℃ 3 min，之后按下述條件進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)(94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃45 s)，最后72℃ 10 min。取上述PCR產(chǎn)物5 μl在瓊脂糖凝膠中電泳，10 μl PCR 產(chǎn)物中加 1 μl 10 × buffer和 0.5 μl Mbo I，37℃處理過夜，電泳檢測;G等位基因?yàn)?06 bp的條帶，T等位基因?yàn)?19 bp和87 bp的條帶，而4b和4a等位基因分別為210 bp、183 bp。-786T＞C PCR條件為:95℃ 3 min，之后按下述條件進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 35 s)，最后72℃ 10 min;取5 μl PCR 產(chǎn)物電泳檢測，10 μl PCR 產(chǎn)物加1 μl 10 ×buffer和0.5 μl Mbo I，37℃處理過夜，電泳檢測;T等位基因片段長度為415 bp，而C等位基因?yàn)?70 bp和45 bp兩個(gè)片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，臨床參數(shù)用s表示，計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料分別用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)?；蛐皖l率和等位基因頻率差異采用χ2檢驗(yàn)，采用Logistic回歸平衡協(xié)變量〔吸煙、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、TC及LDL、空腹血糖(FPG)〕計(jì)算OR值及其95%可信區(qū)間(CI)。

2 結(jié)果

2.1 兩組的一般臨床特征 兩組進(jìn)行了年齡和性別的匹配，有差異的危險(xiǎn)因素有吸煙、SBP、DBP、TC及LDL。見表1。病例組同型半胱氨酸水平為(22.0±20.8)μmol/L。

2.2 內(nèi)皮型氧化氮合酶 (eNOS)基因型在病例組和對(duì)照組的分布 eNOS上G298A，4b/a和786C在病例組和對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，提示eNOS基因型在ICVD患者與健康人群中的分布無差異。將兩組之間有差異的變量包括:吸煙、SBP、DBP、TC、LDL行多元非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示兩組之間仍然沒有顯著性差異 (P＞0.05)。見表2。

表1 兩組一般臨床資料比較(s)

表1 兩組一般臨床資料比較(s)

67.6±10.9 66.0±10.6 0.06 0.92 0.63～1.08男性〔n(%)〕 99(71.7)64(64.0)0.20 0.70 0.40～1.22吸煙〔n(%)〕 69(51.1)20(20.0)＜0.01 4.18 2.31～7.58飲酒〔n(%)〕 29(21.0)21(21.0)0.99 1.00 0.53～1.88 SBP(mmHg)149.2±20.9 121.2±14.4 ＜0.01 0.14 0.01～0.62 DBP(mmHg)86.6±11.3 67.3±8.5 0.02 0.35 0.25～0.74 TC(mmol/L)8.1±39.7 5.3±1.0 0.05 0.73 0.59～0.84 TG(mmol/L)1.6±1.4 1.5±1.1 0.57 0.79 0.68～1.40 HDL(mmol/L)1.1±0.3 1.3±0.2 0.75 0.78 0.60～1.70 LDL(mmol/L)3.0±1.0 2.3±1.0 0.04 0.44 0.34～0.68 FPG(mmol/L)%CI年齡(歲)因素 病例組(n=138)對(duì)照組(n=100)P值 OR值 95 6.0±1.5 5.8±1.6 0.37 0.83 0.58～1.35

2.3 eNOS等位基因在病例組和對(duì)照組的分布 三種等位基因在ICVD患者和健康人群之間的分布有明顯差異。見表3。

表2 病例組和對(duì)照組eNOS基因型分布〔n(%)〕

表3 eNOS等位基因在病例組和對(duì)照組的分布〔n(%)〕

3 討論

內(nèi)皮一氧化氮(nitric oxide，NO)的作用有:維持血管內(nèi)的血液流動(dòng)、血管的舒張、自動(dòng)調(diào)節(jié)、保持血管壁的完整性、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生、抑制血小板聚集及血細(xì)胞黏附、趨化〔5，6〕。NO合酶(NOS)共有3種類型:內(nèi)皮型、神經(jīng)型及誘導(dǎo)型。eNOS存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，在正常機(jī)體內(nèi)由此酶催化合成內(nèi)皮NO，從而發(fā)揮促進(jìn)血管舒張、抑制平滑肌細(xì)胞增生及血小板聚集等作用。eNOS催化L-精氨酸生成瓜氨酸和NO，因此，eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶。eNOS基因位于人類第7條常染色體上，是一條長21 k、包含26個(gè)外顯子的基因片段。人eNOS含有1 203個(gè)氨基酸，其基因?yàn)閱慰截?，定位于染色體7q352q36，全長21～22 kb，包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子。第7外顯子G894T突變使編碼的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天門冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS構(gòu)象改變，從而使eNOS酶活性下降，NO生成減少〔7〕。第4內(nèi)含子處27個(gè)堿基(GAATGTCTAGACCTGATGCAGGGGGTGAG)4次或5次串聯(lián)重復(fù)，此處多數(shù)人的等位基因是5個(gè)重復(fù)序列(4b)，少數(shù)人為4個(gè)重復(fù)序列(4a)。正常人的基因型為4b，一些研究提示4a會(huì)增加腦卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)〔8〕，而啟動(dòng)子-786位點(diǎn)上T-C等位基因的突變同樣也導(dǎo)致NO生成減少。

盡管NO與內(nèi)皮細(xì)胞的功能密切相關(guān)，但關(guān)于G298T與ICVD關(guān)系各研究結(jié)論各不相同。Elbaz等〔7〕對(duì)法國的研究提示eNOS Glu298AspT等位基因純合子與腦梗死，尤其腔隙性梗死有關(guān)，并認(rèn)為該基因遺傳易感性與LDL存在協(xié)同作用;Saidi等〔8〕對(duì)北非突尼斯國ICVD的研究同樣發(fā)現(xiàn)Glu298Asp等位基因在ICVD患者中具有較高的頻率;Cheng〔9〕對(duì)我國人群的研究也發(fā)現(xiàn)了該基因與ICVD存在微小的聯(lián)系，然而關(guān)于土耳其人〔10〕和高加索人〔11〕的研究卻沒有發(fā)現(xiàn) Glu298Asp與 ICVD 之間的關(guān)聯(lián)。本研究也發(fā)現(xiàn)，Glu298Asp與ICVD無明顯相關(guān)，Glu298Asp的各基因型分布在病例組與對(duì)照組之間無明顯差異。上述對(duì)不同人群的研究結(jié)論截然相反，可能為研究人群種族不同可能會(huì)影響研究結(jié)果。

關(guān)于4b/a與ICVD的關(guān)系，國內(nèi)外的研究結(jié)論大相徑庭，Tao等〔12〕的一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)4b/a等位基因在ICVD和健康人群中無差別，我國的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)4bb是腦血管病的保護(hù)基因〔13〕，Majumdar〔14〕雖然認(rèn)為4b/a在15 ～45 歲 ICVD 患者與非ICVD患者之間無明顯差異，但也提示4a是提示女性ICVD患者的危險(xiǎn)因素。本研究同樣提示4b/a在ICVD與健康人群中無差異性分布。這些不同、甚至相互矛盾的結(jié)論的可能原因在于除了樣本大小不一之外，性別差異也是其影響因素之一。其具體的機(jī)制可能是:性激素可以通過eNOS發(fā)揮收縮血管和舒張血管的雙重作用，eNOS可以催化內(nèi)皮NO的生成，同時(shí)也能催化誘導(dǎo)性NO的合成，而后者不利于腦血流的調(diào)節(jié)及側(cè)支循環(huán)的開放，甚至?xí)觿∧X細(xì)胞損傷〔15〕，而這種變化是隨著內(nèi)環(huán)境的變化而變化的。

近些年來，啟動(dòng)子上-786T到C堿基的突變與ICVD的關(guān)系也是研究的熱點(diǎn)之一。-786T到C堿基的突變會(huì)導(dǎo)致NO的合成下降〔16〕。Howard等〔17〕的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶 -786TT 的黑人女性患缺血性腦卒中的概率是無此基因女性的3倍，而在白人女性中則沒有發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系。Munshi〔18〕對(duì)南印第安人的研究則發(fā)現(xiàn)4b/a與ICVD的發(fā)生存在明顯相關(guān)，與健康人群比較腦卒中患者中4a等位基因頻率較高。在中國人中也存在著這樣的聯(lián)系。Moe等〔19〕在新加坡人群中的研究也提出初次ICVD與NOS無明顯關(guān)系，這與本研究結(jié)果一致。從上述的研究結(jié)論中可以推測，eNOS基因多態(tài)性不僅與種族相關(guān)，在不同性別人群中也可能存在差別，同時(shí)樣本種類的選擇也可能會(huì)影響到研究的結(jié)論。

本研究提示，吸煙、SBP、TC及LDL在病例組與對(duì)照組間存在明顯的差異，這也預(yù)示作為腦血管病的危險(xiǎn)因素，傳統(tǒng)的環(huán)境因素在ICVD的病因中也許占據(jù)了更大的成份。

1 Polychronopoulos P，Gioldasis G，Ellul J，et al.Family history of stroke in stroke types and subtypes〔J〕.J Neurol Sci，2002;195(2):117-22.

2 Brass LM，Isaacsohn JL，Merikangas KR，et al.A study of twins and stroke〔J〕.Stroke，1992;23(2):221-3.

3 Wannamethee SG，Shaper AG，Ebrahim S.History of parental death from stroke or heart trouble and the risk of stroke in middle-aged men〔J〕.Stroke，1996;27(9):1492-8.

4 Gao S，Wang YJ，Xu AD，et al.Chinese ischemic stroke subclassification〔J〕.Frontiers Neruol，2011;2(6):6.

5 White RP，Vallance P，Markus HS.Effect of inhibition of nitric oxide synthase on dynamic cerebral autoregulation in humans〔J〕.Clin Sci，2000;99(6):555-60.

6 Garg UC，Hassid A.Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells〔J〕.J Clin Invest，1989;83(5):1774-7.

7 Elbaz A，Poirier O，Moulin T，et al.Association between the Glu298Asp polymorphism in the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene and brain infarction.The GEN1C investigators〔J〕.Stroke，2000;31(7):1634-9.

8 Saidi S，Mallat SG，Almawi WY，et al.Endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp，4b/a，and-786T ＞ C gene polymorphisms and the risk of ischemic stroke〔J〕.Acta Neurol Scand，2010;121(2):114-9.

9 Cheng J，Liu J，Li X，et al.Effect of polymorphisms of endothelial nitric oxide synthase on ischemic stroke:a case-control study in a Chinese population〔J〕.Clin Chim Acta，2008;392(1-2):46-51.

10 Guldiken B，Sipahi T，Guldiken S，et al.Glu298Asp polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene in Turkish patients with ischemic stroke〔J〕.Mol Biol Rep，2009;36(6):1539-43.

11 Casas JP，Hingorani AD，Bautista LE，et al.Meta-analysis of genetic studies in ischemic stroke:thirty-two genes involving approximately 18，000 cases and 58，000 controls〔J〕.Arch Neurol，2004;61(11):1652-61.

12 Tao HM，Chen GZ.Endothelial NO synthase gene polymorphisms and risk of ischemic stroke:a meta-analysis〔J〕.Neurosci Res，2009;64(3):311-6.

13 Shi C，Kang X，Wang Y，et al.The coagulation factorⅤLeiden，MTHFRC677T variant and eNOS 4ab polymorphism in young Chinese population with ischemic stroke〔J〕.Clin Chim Acta，2008;396(1-2):7-9.

14 Majumdar V，Nagaraja D，Karthik N，et al.Association of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with early-onset ischemic stroke in South Indians〔J〕.J Atheroscler Thromb，2009;17(1):45-53.

15 呂曉紅，張 巨，張見影.大劑量一氧化氮合酶抑制劑在局灶性腦缺血中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004;30(2):270-2.

16 Nakayama M，Yoshimura M，Sakamoto T，et al.A-786T ＞C polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene reduces serum nitrite/nitrate levels from the heart due to an intracoronary injection of acetylcholine〔J〕.Pharmacogenet Genomics，2006;16(5):339-45.

17 Howard TD，Giles WH，Xu J，et al.Promoter polymorphisms in the nitric oxide synthase 3 gene are associated with ischemic stroke susceptibility in young black women〔J〕.Stroke，2005;36(9):1848-51.

18 Munshi A，Rajeshwar K，Kaul S，et al.VNTR polymorphism in intron 4 of the eNOS gene and the risk of ischemic stroke in a South Indian population〔J〕.Brain Research Bulletin，2010;82(5-6):247-50.

19 Moe KT，Woon FP，De Silva DA，et al.Association of acute ischemic stroke with the MTHFR C677T polymorphism but not with NOS3 gene polymorphisms in a Singapore population〔J〕.Eur J Neurol，2008;15(12):1309-14.