人胎盤羊膜包裹的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損

張雁儒 ，姚俊娜，周明武，李月白，王義生

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室鄭州450001 3)洛陽(yáng)白馬寺正骨醫(yī)院骨科洛陽(yáng)471002 4)中國(guó)人民解放軍第153 中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科鄭州450042 5)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室鄭州450001

△男，1970年8月生，碩士，副教授，研究方向:周圍神經(jīng)損傷，E-mail:zhangyanru818@yahoo.com.cn

周圍神經(jīng)缺損是臨床上常見的創(chuàng)傷，脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)可為缺損神經(jīng)修復(fù)再生提供神經(jīng)基質(zhì)管和雪旺細(xì)胞基底板層等良好的再生支架物質(zhì)而成為研究的熱點(diǎn)［1-3］。羊膜為母體與胎兒間的一層生物膜，具有免疫赦免性和良好的生物兼容性，且來源廣泛，用其包裹神經(jīng)后可形成假鞘進(jìn)而發(fā)揮基底膜的作用，可為神經(jīng)纖維的再生構(gòu)建一個(gè)良好的微環(huán)境［4-6］。作者采用人胎盤羊膜包裹的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損，探討胎盤羊膜包裹的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植技術(shù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器 健康雜種犬15只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(20±4)kg，雌雄不拘，分籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)1 只，自由攝食、飲水。EC 耳腦膠(廣州白云醫(yī)用膠有限公司)，ASX-1 手術(shù)顯微鏡(上海安信光學(xué)儀器制造有限公司)，Wi3554 雙極電凝器(北京東西儀科技有限公司)，八通道肌電儀(合肥旭寧科技有限公司)，RD-201V 型冷凍離心機(jī)(日本島津公司)。

1.2 胎盤羊膜的制備 健康順產(chǎn)胎兒的羊膜由洛陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，參考陳有剛等［6］的方法制備，反復(fù)清洗羊膜組織直至在光鏡下觀察清潔、透亮為止，然后投入1 g/L NH4OH 溶液中，稍后取出并放入250 mL 磷酸緩沖液中，將其分割成寬2～4 cm、長(zhǎng)4～9 cm 的條塊樣，并保存在－40℃冰箱中。

1.3 犬脫細(xì)胞神經(jīng)的制備 取3 只犬麻醉后在右股內(nèi)側(cè)作長(zhǎng)約10 cm 縱行切口，自股內(nèi)側(cè)肌間隙暴露并切斷股動(dòng)脈，放血處死動(dòng)物，向內(nèi)后方牽開后股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)，兩側(cè)均切取7～11 cm 坐骨神經(jīng)干，按照Sondell 等［7］的方法萃取，得到犬脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)，滅菌處理后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和坐骨神經(jīng)缺損動(dòng)物模型制備 12只犬按照隨機(jī)數(shù)字表法分為同種異體神經(jīng)移植(A)組和羊膜包裹的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植(B)組，每組6 只。麻醉犬后行右后肢體后側(cè)縱行切口，牽開股二頭肌，暴露并切除一段坐骨神經(jīng)，造成長(zhǎng)約6.0 cm 長(zhǎng)的神經(jīng)缺損。A組取相應(yīng)長(zhǎng)度同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)，在顯微鏡(×10)下用8/0 無(wú)損傷縫合線行神經(jīng)外膜縫合。B組行取相應(yīng)長(zhǎng)度的同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)遠(yuǎn)斷端剪去2 mm，用8/0 無(wú)損傷縫合線在顯微鏡下行端端對(duì)合，神經(jīng)斷端與移植神經(jīng)兩端長(zhǎng)度及直徑匹配對(duì)合后，吻合口采用胎盤羊膜涂抹耳腦膠，黏合固定(羊膜需分別超出斷端遠(yuǎn)、近端吻合口1.5 cm)，注意避免耳腦膠污染吻合口。2組均采用肌肉覆蓋保護(hù)移植的坐骨神經(jīng)，徹底止血后，縫合關(guān)閉傷口，創(chuàng)面紗布覆蓋，繃帶固定。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般情況 術(shù)后犬分籠飼養(yǎng)，8 周內(nèi)詳細(xì)觀察并記錄其精神狀態(tài)、肢體活動(dòng)、傷口情況和患肢運(yùn)動(dòng)功能。術(shù)后16 周內(nèi)詳細(xì)觀察并記錄患足潰瘍形成及愈合情況、患肢功能的恢復(fù)情況及并發(fā)癥的發(fā)生情況。

1.5.2 形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后16 周，取坐骨神經(jīng)移植段，取材分別包含神經(jīng)近端吻合口以近及遠(yuǎn)端吻合口以遠(yuǎn)1 cm，大體形態(tài)觀察后固定、常規(guī)石蠟包埋，切片范圍為包含神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)近端2 mm，采用連續(xù)切片法，吻合口處行縱切片，其他部位行橫切片。常規(guī)HE 染色、髓鞘染色，計(jì)數(shù)神經(jīng)束內(nèi)軸突，計(jì)算軸突密度。

1.5.3 肌電圖和神經(jīng)電生理檢測(cè) 術(shù)后16 周時(shí)暴露并游離術(shù)側(cè)移植段及對(duì)側(cè)坐骨神經(jīng)，將刺激電極置于近端神經(jīng)吻合口處，記錄電極刺入比目魚肌，記錄比目魚肌誘發(fā)電位的波幅和時(shí)限、雙側(cè)坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 處理數(shù)據(jù)，2組犬術(shù)后16 周軸突密度、比目魚肌誘發(fā)電位的波幅和時(shí)限以及神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較的應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組犬術(shù)后一般情況 術(shù)后2～6 周，2組犬術(shù)側(cè)足部紅腫、潰瘍及跛行，小腿三頭肌力量較差，行走時(shí)踝關(guān)節(jié)不能完全直立。術(shù)后7 周，2組犬運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)，A組足部潰瘍愈合較B組慢。術(shù)后16 周，A組犬足部及小腿紅腫; B組犬神經(jīng)功能恢復(fù)，小腿肌肉肌力恢復(fù)，犬右后肢能夠站立。

2.2 2組移植段神經(jīng)大體觀察 16 周時(shí)，A組移植段神經(jīng)連續(xù)性好，與周圍組織粘連嚴(yán)重，周圍局部組織增生形成疤痕，吻合口可觸及硬結(jié)，局部呈梨形改變，神經(jīng)表面血管化程度差，移植段遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)干變細(xì)變硬。B組移植段神經(jīng)連續(xù)性好，無(wú)移植段神經(jīng)的脫落及分離，與周圍組織沒有硬化性瘢痕粘連，移植段神經(jīng)周圍炎癥反應(yīng)不明顯，神經(jīng)表面有明顯毛細(xì)血管網(wǎng)，吻合口略膨大，未觸及硬結(jié)及卡壓性梨形改變，移植段遠(yuǎn)近端神經(jīng)干外觀基本正常。

2.3 2組神經(jīng)移植體組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 術(shù)后16 周，2組均可見有髓神經(jīng)纖維，密度分布欠規(guī)則不均勻。見圖1、表1。B組可見大量再生的神經(jīng)纖維和雪旺細(xì)胞。

圖1 A組(A)和B組(B)神經(jīng)移植體組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

2.4 2組術(shù)后16 周肌電圖和神經(jīng)電生理測(cè)量結(jié)果見表1。

表1 2組術(shù)后16 周軸突密度、比目魚肌肌電圖和神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較

3 討論

周圍神經(jīng)缺損是臨床常見病，若不能盡快修復(fù)缺損的神經(jīng)，將造成靶器官長(zhǎng)期失神經(jīng)支配、失神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致肌肉萎縮、感覺功能喪失等，最終將嚴(yán)重影響患者的感覺運(yùn)動(dòng)功能。自體神經(jīng)移植效果雖然可靠，但是其來源非常有限，并且切取自體神經(jīng)會(huì)給患者帶來新的創(chuàng)傷。

作者采取優(yōu)化的化學(xué)萃取方法制備同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)，不僅有效地清除了異體神經(jīng)的免疫原性成分，同時(shí)還保留了雪旺細(xì)胞、基底膜及其組織結(jié)構(gòu)的完整。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者［8-10］采用此方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中處理同種異體神經(jīng)作為橋接供體效果滿意。該研究結(jié)果表明，與單純同種異體神經(jīng)移植比較，由人胎盤羊膜包裹的同種異體移植段神經(jīng)無(wú)脫落及分離，與周圍組織沒有粘連，神經(jīng)表面有新生毛細(xì)血管網(wǎng)，光鏡下可見大量再生的神經(jīng)纖維和雪旺細(xì)胞，提示人胎盤羊膜包裹的同種異體神經(jīng)移植修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損，更有利于軸突、神經(jīng)纖維細(xì)胞的再生及神經(jīng)功能的恢復(fù)。

神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌電圖是檢測(cè)周圍神經(jīng)電生理功能最常用的觀察指標(biāo)，MNCV 和SNCV 分別反映了坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)和感覺纖維的功能狀態(tài)。該研究結(jié)果顯示，術(shù)后16 周，B組犬的比目魚肌誘發(fā)電位波幅和時(shí)限明顯高于A組，而2組患側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是否是由于觀察時(shí)間較短所致，尚需在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察。

綜上所述，異體神經(jīng)經(jīng)化學(xué)萃取后是抗原性極低的神經(jīng)移植替代材料，人胎盤羊膜包裹脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)可以形成一個(gè)相對(duì)密閉長(zhǎng)形的管道-神經(jīng)間室，充分發(fā)揮接觸誘導(dǎo)作用，能夠引導(dǎo)再生神經(jīng)軸突從斷離神經(jīng)的近端趨向遠(yuǎn)端，避免縫線對(duì)吻合口的干擾，結(jié)合應(yīng)用醫(yī)用膠，選擇直徑、長(zhǎng)度相同的異體犬脫細(xì)胞神經(jīng)，減少神經(jīng)軸突的錯(cuò)向再生，同時(shí)又保證了足夠的吻合強(qiáng)度，可避免術(shù)后神經(jīng)斷端分離、脫落現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)提高周圍神經(jīng)的修復(fù)效果具有積極的作用。作者的實(shí)驗(yàn)研究證明在神經(jīng)再生過程中創(chuàng)造一個(gè)良好的微環(huán)境能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)纖維的高選擇性再生，同時(shí)也表明，胎盤羊膜包裹同種異體神經(jīng)在周圍神經(jīng)修復(fù)中能減少吻合口部位疤痕，有利于神經(jīng)再生，是一種簡(jiǎn)便、有效的周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)方法，具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究應(yīng)用。

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