子癇前期患者胎盤組織中內(nèi)皮分化基因2的表達

李留霞 ，吳改英，王 寧，張 毅，郭瑞霞，張孝艷

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

△女，1962年11月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤和圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)，E-mail:llxia698@163.com

子癇前期是妊娠婦女特有的疾病，以高血壓和蛋白尿為主要特征，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因，其發(fā)病機制至今尚不明確。血管內(nèi)皮損傷及凝血異常是比較公認的子癇前期的病理機制之一［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)來源于活化的血小板，可促進血小板聚集及血栓形成，與凝血功能異常及內(nèi)皮損傷有關(guān)。LPA 主要通過其G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，其特異性受體為內(nèi)皮分化基因(endothelial differentiation gene，Edg)2、Edg3 和Edg4。作者前期的研究［3-4］發(fā)現(xiàn)LPA 在子癇前期婦女血中明顯升高，并且與疾病的嚴重程度相關(guān)，子癇前期患者胎盤組織中Edg4 和Edg7 蛋白表達明顯升高。該研究應(yīng)用免疫組化SP法和RT-PCR 方法檢測子癇前期患者胎盤組織中Edg2 蛋白和mRNA 的表達，探討Edg2 與子癇前期發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年11月至2011年5月收治的子癇前期患者40例，其中子癇前期輕度組20例，年齡22～41(30.1±4.9)歲，孕(36.3±2.8)周;重度組20例，年齡20～42(30.2±6.1)歲，孕(33.0±4.0)周。診斷標準參考文獻［1］的妊娠期高血壓疾病分類標準。選取同期入院正常晚期妊娠婦女20例作為對照組，年齡21～41(29.5±0.8)歲，孕(39.3±0.1)周。排除慢性高血壓、腎臟病病史、各類炎癥性疾病; 對照組無妊娠并發(fā)癥。

1.2 標本的采集及處理 妊娠婦女自然分娩或選擇性剖宮產(chǎn)，胎盤娩出后，迅速取出母面中央約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 的組織，避開出血、鈣化、機化的部位。用生理鹽水反復(fù)漂洗后，1 份用干紗布吸去表面水分，裝入RNA 酶滅活的凍存管，迅速置于液氮中保存;另1 份置入甲醛溶液固定，用于免疫組化測定。

1.3 胎盤組織中Edg2 蛋白檢測 將胎盤組織常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水并微波修復(fù)抗原。采用免疫組化SP 法檢測，一抗為兔抗人Edg2 蛋白多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，稀釋100 倍使用，二抗為山羊抗兔IgG 抗體，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以PBS 代替一抗作為陰性對照。200 倍鏡下選取10 個視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，參照Fromowitz 等［5］的綜合計分法進行半定量分析，根據(jù)陽性細胞分布范圍和染色強度確定Edg2 的表達水平。以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致的為陰性細胞。陽性細胞百分數(shù):≤5%為0 分，～25%為1 分，～49%為2分，≥50%為3 分; 陽性細胞著色強度:無著色為0分，淺棕褐色為1 分，棕褐色為2 分，深褐色為3 分;兩項評分相加:0～1 分為陰性，＞1 分為陽性。

1.4 胎盤組織中Edg2 mRNA 檢測 采用Trizol一步法提取胎盤組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas 公司)進行反轉(zhuǎn)錄后行PCR 擴增。引物均根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫目的基因cDNA 序列，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。Edg2上游引物序列5’-GACCCAATACTCGGAGACTGAC-3’，下游引物序列5’-AACCACCATTACCACAAAG GTC-3’; 擴增產(chǎn)物大小為341 bp。內(nèi)參照β-actin上游引物序列5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG -3’，擴增產(chǎn)物大小為434 bp。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性90 s;94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)含20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Quantity One 軟件對凝膠電泳圖像進行分析，以Edg2 與β-actin 條帶灰度值的比值作為Edg2 mRNA 相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)，3組胎盤組織中Edg 2 蛋白陽性表達率的比較應(yīng)用χ2檢驗，胎盤組織中Edg2 mRNA 的相對表達量應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組胎盤組織中Edg2 蛋白的表達 3組胎盤組織中均可檢測到Edg2 蛋白的表達，主要表達于絨毛滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞的胞質(zhì)和胞膜，見圖1。各組胎盤絨毛滋養(yǎng)和蛻膜細胞中Edg2 蛋白陽性表達率的比較見表1。

圖1 3組胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞(A)和蛻膜細胞(B)中Edg2 蛋白的表達(SP，×200)

表1 3組胎盤組織中Edg2 蛋白和mRNA 的表達

2.2 3組胎盤組織中Edg2 mRNA 的表達 結(jié)果見圖2、表1。

圖2 3組胎盤組織中Edg2 mRNA 的表達

3 討論

LPA 是一種具有細胞間信號傳導(dǎo)作用的多功能磷脂分子，通常以自分泌或旁分泌的形式釋放到細胞外，主要通過特異性G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮各種生物學(xué)功能［6］。LPA 可來源于多種細胞，主要來源于活化的血小板，血小板活化后在磷脂酶作用下水解膜磷脂產(chǎn)生LPA，釋放入血，作為血漿的正常成分調(diào)節(jié)一些正常的生命活動［7-9］。LPA 與高血壓進展與維持有關(guān)［10］。

作者前期研究［4］顯示，妊娠期高血壓病患者血漿LPA 水平均較正常晚孕組升高，且子癇前期患者血漿LPA 濃度最高。有研究［11］發(fā)現(xiàn)Edg2 能誘導(dǎo)細胞凋亡，可能通過非依賴LPA 途徑發(fā)揮作用。據(jù)此推測，LPA 可能通過Edg2 在子癇前期患者胎盤組織細胞凋亡中發(fā)揮一定作用。LPA 可能與胎盤組織中不同組織細胞上的受體結(jié)合后發(fā)揮不同的作用:LPA 與胎盤滋養(yǎng)細胞受體結(jié)合后引起或通過影響其他細胞因子誘導(dǎo)細胞凋亡，使其母血物質(zhì)交換功能下降;LPA 與胎盤蛻膜細胞受體結(jié)合，影響細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，使血壓升高，促使血管收縮和血小板凝集，并可能與胎盤局部血管硬化性病變有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，Edg2 蛋白在患者胎盤絨毛滋養(yǎng)和蛻膜細胞中呈高表達，Edg2 mRNA 在患者胎盤組織中呈高表達，且與疾病的嚴重程度有關(guān)，提示LPA 受體Edg2 可能參與了子癇前期疾病的發(fā)生。

總之，胎盤組織中LPA 受體Edg2 異常高表達可能促進子癇前期疾病的發(fā)生發(fā)展。

［1］豐有吉，沈鏗.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.2 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:80

［2］李霞，周麗，宋春雨.急性缺血性腦血管病患者血漿溶血磷脂酸和總磷脂水平的變化［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2009，17(5):395

［3］李留霞，張建好，王淼，等.妊娠期高血壓疾病患者血漿溶血磷脂酸水平的測定及其意義［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2007，41(1):58

［4］李留霞，周蔚，喬玉環(huán)，等.妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中溶血磷脂酸受體蛋白Edg4、7 的表達及其意義［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2007，42(6):386

［5］Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al.ras p21 expression in the progression of breast cancer［J］.Hum Pathol，1987，18(12):1268

［6］Chen X.Lysophosphatidic acid receptors and the downstream signaling pathways in regulation of cardiac cell growth［J］.Sheng Li Xue Bao，2007，59(5):619

［7］Sakamoto S，Yokoyama M，Zhang X，et al.Increased expression of CYR61，an extracellular matrix signaling protein in human benign prostatic hyperplasia and its regulation by lysophosphatidie acid［J］.Endocrinology，2004，145(6):2929

［8］Xing Y，Ganji SH，Noh JW，et al.Cell density-dependent expression of EDG family receptors and mesangial cell proliferation:role in lysophosphatidic acid-mediated cell growth［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，287(6):F1250

［9］Eichholtz T，Jalink K，F(xiàn)ahranfort I，et al.The bioactive phospholipid lysophosphatidic acid is released from activited plateleis［J］.Biochem J，1993，291(Pt3):677

［10］Pucci ML，Tong XL，Miller KB，et al.Calcium-and protein kinase C-dependent basal tone in the aorta of hypertensive rats［J］.Hypertension，1995，25(4 Pt 2):752

［11］顧建娟，蘇悅，汪萍.卵巢腫瘤患者血漿溶血磷脂酸水平及Edg-2/Edg-7 表達研究［J］.南通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2006，26(6):432