水稻Xa21基因啟動子序列分析及其在不同條件下的表達特征

牟少亮，劉志欽，賴 燕，蔡漢陽，何水林

(福建農林大學:a.生命科學學院，b.作物遺傳改良與綜合利用教育部重點實驗室，c.作物科學學院，福建福州350002)

在自然生態(tài)環(huán)境中植物遭受各種病害的危害，并在長期進化過程中形成復雜的抗病機制，包括PTI(PAMP triggered immunity)和ETI(effector triggered immunity)2種彼此相互關聯(lián)的抗病反應［1-2］。其中ETI是由抗性基因R(resistance gene)介導的?；钥共》磻cPTI相比，其強度大而持久。目前已經克隆獲得多種植物的R基因并對其抗病功能進行了分析，結構分析結果表明:這些R基因可分成NBSLRR、eLRR-TM、eLRR-TM-pkinase、STK(serinethreonine kinase)和其他5大類型［3］。它們的作用符合“基因對基因”學說，在植物抗病基因工程中具有重要的應用價值，但迄今為止對這些抗病基因表達及調控機制的研究報道還很少［4］。

水稻(Oryza sativa L.)是重要的糧食作物之一，白葉枯病〔Xanthomonas campestris pv.oryzae(Ishiyama)Dye〕是水稻生產上僅次于稻瘟病〔Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr.〕的主要病害，不僅可導致水稻大幅度減產，而且還影響稻米品質［5］。由于其危害嚴重，化學防治難以奏效，因此，培育抗病品種是有效防治水稻白葉枯病的重要手段之一［6］。目前，已報道的水稻白葉枯病抗性基因有30多個［7］，其中，Xa21基因是最早克隆的水稻白葉枯病廣譜抗性基因，屬于STKLRR類抗性基因，定位于水稻第11號染色體。Xa21基因編碼的蛋白可以通過胞外LRR(leucine-rich repeat)域識別病原物的無毒基因編碼產物，然后將信號傳導到細胞內活化STK的表達，進而激活細胞內的防御反應［7-8］。研究表明:Xa21基因可下調其信號通路上游調節(jié)蛋白的編碼基因，激活PR(pathogenesisrelated)基因表達［9］;Xa21基因介導的抗病反應受發(fā)育時期的調控，植株在2葉期感病、5葉期有75%抗病、9葉期之后完全抗?。?0］。雖然關于Xa21基因的表達已有報道［10-11］，但這些研究結果存在爭議。

為了進一步闡明水稻Xa21基因的表達及其調控機制，作者以水稻品種‘日本晴’(‘Nipponbare’)為實驗材料，對Xa21基因5'端的上游啟動子進行克隆及序列分析，并獲得了其與GUS(β-葡萄糖苷酸酶)報告基因的轉基因水稻T1代株系，通過分析轉基因水稻中GUS基因表達的組織和器官特異性及其對不同逆境和逆境相關激素信號分子的應答情況，確定水稻Xa21基因5'端上游啟動子的表達特性，以期為抗白葉枯病水稻品種的育種研究奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用水稻品種‘日本晴’、大腸桿菌〔Escherichia coli(Migula)Castellani et Chalmers〕菌株DH10B和根癌農桿菌〔Agrobacterium tumefaciens(Smith et Towns.)Conn.〕菌株EHA105均為本實驗室保存的實驗材料;pMD18-T質粒和DL2000均購自寶生物工程(大連)有限公司;pDNOR-207和pMDC163質粒由瑞士蘇黎世大學Curtis教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 啟動子克隆和測序 參照GenBank上公布的水稻品種‘日本晴’基因組DNA序列進行上、下游引物的設計，其中，上游引物Xa21-F序列為5'-AGA GTTGCTGCCCCTTGAT-3'，下游引物Xa21-R序列為5'-GTGCAAGCTAAGACAGCAAGA-3'。

參照文獻［12］采用CTAB法提取基因組總DNA，并以其為模板進行PCR擴增。擴增反應在Tgradient型PCR儀(德國Biometra公司)上進行。反應體系總體積為 50 μL，包括0.2 μg 模板 DNA、10×PCR buffer 5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2 μL和5 U·μL-1Ex Taq DNA聚合酶0.4 μL，用滅菌雙蒸水補足至50 μL。擴增程序為:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸2 min，共計35個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。

擴增反應結束后將獲得的PCR產物用質量體積分數(shù)1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以DL2000為Marker;采用天根生化科技(北京)有限公司生產的DNA純化回收試劑盒進行產物回收，并將回收產物連接到pMD-18T載體上，交送北京三博遠志生物技術有限公司測序。

1.2.2 GUS融合表達載體的構建 利用Gateway技術［13］，分別以 pDNOR-207和 pMDC163為入門載體和目的載體，構建Xa21基因啟動子的GUS融合表達載體。PCR驗證采用Xa21基因啟動子的特異擴增引物，驗證正確后轉化到根癌農桿菌EHA105菌株中用于水稻遺傳轉化。

1.2.3 水稻遺傳轉化及轉基因植株的獲得 以水稻品種‘日本晴’的成熟胚為受體材料，參照Toki等［14］的方法進行愈傷組織的誘導和轉化。從獲得的轉基因水稻植株中提取DNA，利用潮霉素基因特異引物HypF和HypR進行PCR驗證，其中，上游引物HypF序列為5'-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3'，下游引物HypR序列為5'-ATCTTAGCCAGACGAGCGGG-3'。

1.2.4 GUS檢測與定量分析 根據(jù)潮霉素基因特異引物對轉基因水稻的PCR驗證結果，收集陽性植株的T1代種子;選擇T1代種子分離比接近3∶1的株系進行Xa21基因啟動子驅動的GUS活性的組織染色和定量分析。參照Jefferson［15］的方法，對T1代轉基因水稻的根、莖和葉分別進行GUS組織化學染色分析，GUS染色液包含0.2 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、0.1 mol·L-1鐵氰化鉀、0.1 mol·L-1亞鐵氰化鉀、1.0 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉和質量體積分數(shù)0.1%X-Gluc。取T1代轉基因水稻的根、莖和葉，并在不同發(fā)育時期(水稻3葉期、5葉期和8至9葉期)采集葉片，參照曾凡鎖等［16］的分光光度法測定GUS活性，以1 min內使PNPG(4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)水解生成1 nmol·L-1對硝基苯酚的酶量為1個酶活力單位。

1.2.5 對轉基因植株的處理方法 收獲的T1代轉基因種子經潮霉素抗性篩選后進行培養(yǎng)，7～8 d后將正常萌發(fā)的綠色幼苗移栽至裝有土壤的塑料花盆中，待幼苗長到4至5葉期時分別進行各種處理，對照組植株不進行任何處理，然后取樣按照上述方法進行GUS定量分析。機械損傷處理方法:用解剖刀在幼苗葉片上切割數(shù)處2～3 cm傷口，12 h后取葉片進行GUS活性測定。干旱處理方法:停止?jié)菜?8 h后待幼苗葉片出現(xiàn)微蔫狀態(tài)時取葉片進行GUS活性測定。激素處理方法:分別用500 μmol·L-1水楊酸(SA)、100 μmol·L-1脫落酸(ABA)和100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)進行葉面噴灑，每株10 mL，12 h后取葉片進行GUS活性測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 10.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和處理;GUS活性為10個單株的平均值。

2 結果和分析

2.1 水稻Xa21基因啟動子的克隆和序列分析

以水稻品種‘日本晴’為實驗材料，通過PCR擴增得到1條長1 982 bp的片段(圖1)，將該片段的測序結果(圖2)與GenBank上報道的水稻品種‘日本晴’的序列進行比對，顯示二者的序列同源性百分率為99.7%。將獲得的此片段序列登錄至啟動子順式元件預測網站 (http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行分析［17］，結果表明:除了啟動子的基本元件(TATA-box和CAAT-box)外，在該片段上還預測到一些逆境信號相關元件，如:GCC-box(乙烯應答元件)、A-box(順式調控元件)、TC-rich repeats(逆境應答元件)、MBS(MYB結合位點)、LTR(低溫應答元件)和W-box(病原菌應答元件)，表明擴增獲得的水稻Xa21基因啟動子可能在外界逆境脅迫時具有誘導能力。

圖1 水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of Xa21 gene promoter of cultivar‘Nipponbare’of Oryza sativa L.

2.2 在轉基因水稻中Xa21基因啟動子的表達特征

圖2 水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子序列及其相關元件Fig.2 Sequence of Xa21 gene promoter of cultivar‘Nipponbare’of Oryza sativa L.and its related elements

圖3 T1代轉基因水稻不同器官GUS活性的組織化學染色結果Fig.3 Histochemical staining result of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)

2.2.1 在不同器官中的表達特征 GUS組織化學染色分析結果表明(圖3):在T1代轉基因水稻的根、莖和葉中都能檢測到GUS活性，特別是在根尖的中柱組織中GUS活性明顯高于其他組織(圖3-D)，具有一定的組織表達特異性。而GUS活性定量檢測結果顯示(表1):轉基因水稻幼苗根的GUS活性是葉片的2.31倍，且二者間的差異達到極顯著水平(P＜0.01);莖的GUS活性是葉片的1.93倍，二者間的差異達到顯著水平(P＜0.05);根的GUS活性略高于莖，但二者間的差異不顯著(P＞0.05)。

表1 T1代轉基因水稻不同器官中GUS活性比較(±SD)1)Table 1 Comparison of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)(±SD)1)

表1 T1代轉基因水稻不同器官中GUS活性比較(±SD)1)Table 1 Comparison of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)(±SD)1)

1)同列中不同的小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

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2.2.2 在不同發(fā)育時期的表達特征 T1代轉基因水稻3葉期、5葉期和8至9葉期葉片的GUS活性見表2。由表2可見:由Xa21基因啟動子驅動的GUS活性受到水稻發(fā)育時期的影響;在8至9葉期葉片的GUS活性極顯著高于3葉期(P＜0.01)，是3葉期的2.68倍;8至9葉期葉片的GUS活性也顯著高于5葉期(P＜0.05)，是5葉期的 2.00倍;而5葉期葉片的GUS活性略高于3葉期，但差異不顯著(P＞0.05)。表明隨轉基因水稻苗齡的增長，Xa21基因啟動子驅動的GUS活性逐漸增加。

表2 不同發(fā)育期T1代轉基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)1)Table 2 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)at different developmental stages(±SD)1)

表2 不同發(fā)育期T1代轉基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)1)Table 2 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)at different developmental stages(±SD)1)

1)同列中不同的小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

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2.2.3 在不同逆境及激素處理條件下的表達特征通過GUS活性定量分析，在干旱、機械損傷以及不同激素處理條件下T1代轉基因水稻葉片中GUS的活性見表3。由表3可見:機械損傷12 h后，轉基因水稻葉片中的GUS活性顯著高于對照(P＜0.05)，為對照的1.24倍;干旱處理48 h后，轉基因水稻葉片中的GUS活性變化并不明顯;用100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理12 h后，轉基因水稻葉片中的GUS活性極顯著高于對照(P＜0.01)，為對照的 1.39倍;經 500 μmol·L-1水楊酸和100 μmol·L-1脫落酸處理 12 h后，轉基因水稻葉片中的GUS活性與對照差異不顯著。

表3 在不同處理條件下T1代轉基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)Table 3 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)under different treatments(±SD)

表3 在不同處理條件下T1代轉基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)Table 3 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)under different treatments(±SD)

1)＊＊:對照與處理組間差異極顯著(P＜0.01)The extremely significant difference between the control and treatment group(P＜0.01);*:對照與處理組間差異顯著(P＜0.05)The significant difference between the control and treatment group(P＜0.05).

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3 討論和結論

研究結果表明:從水稻品種‘日本晴’中擴增得到1條長度為1 982 bp的片段，該片段與GeneBank中登錄的水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子序列的同源性高達99.7%，據(jù)此推斷該序列為Xa21基因啟動子。通過順式作用元件預測該序列包含有GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR 和 W-box 等逆境信號相關元件。GUS活性分析結果顯示:該啟動子在水稻的根、莖和葉中均能表達，其中在根中的表達量最高，特別是在根尖的中柱組織中集中表達;在不同發(fā)育時期以及在不同的逆境和外源激素處理條件下，該啟動子均能表達，但表達量有明顯差異，其中，8至9葉期表達量最高，機械損傷以及100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理均能促進該啟動子的表達。

基因的結構、表達與其功能之間相互適應，這是生物在長期進化過程中形成的一種重要的適應機制。Century等［10］的研究結果表明:水稻不同發(fā)育時期Xa21基因的表達變化不顯著，而且轉基因植株對白葉枯病和創(chuàng)傷處理不敏感，說明Xa21基因很可能是在轉錄后水平進行調控;而Park等［11］的研究結果則表明:白葉枯病可以誘導水稻Xa21基因的表達，在幼苗期和成苗期過量表達Xa21基因都可以增加水稻的抗病性。造成上述研究結果不一致的原因可能是不同研究者采用的PCR反應引物不同所致。由于水稻基因組中抗病基因家族很大，不同成員之間存在著序列同源性，研究人員在設計引物時模板區(qū)域的選擇有一定差異，因此難以獲得基因家族特定成員特異性表達的數(shù)據(jù)。啟動子是基因表達調控的重要元件，啟動子的活性在很大程度上可以反映基因的表達情況，因此通過分析基因啟動子的表達特征推測基因的表達，可以彌補上述研究的不足之處。根據(jù)本研究結果，推測水稻Xa21基因的表達明顯受水稻發(fā)育時期的影響，隨著水稻苗齡的增長，Xa21基因的表達水平逐漸升高，說明在水稻不同發(fā)育期的抗性差異與Xa21的表達密切關聯(lián)。

水稻白葉枯病是一種細菌性病害，自然條件下從寄主的傷口或自然開放的孔口(如水孔)侵入，進入木質部后繁殖并轉移到植株的全身，其危害主要發(fā)生在葉片及葉鞘部位［5］。Chen 等［18］的研究結果表明:在水稻根系中，Xa21基因也能對白葉枯病病原菌產生抗性。本研究結果表明:Xa21基因啟動子驅動的GUS活性在水稻根尖的中柱區(qū)域表達量明顯較高，這與Xa21介導的白葉枯病抗性特征相吻合［18］。茉莉酸(JA)是植物體內重要的內源性信號分子，茉莉酸信號途徑參與了水稻對白葉枯病的抗病反應［19-20］。在本研究中，外源茉莉酸甲酯可以顯著增強水稻中Xa21基因啟動子驅動的GUS活性，也說明Xa21介導的白葉枯病抗性依賴于茉莉酸信號通路。

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