活血止痛膏對(duì)兔骨骼肌急性鈍挫傷后IIb型MHC、I型及III型膠原mRNA表達(dá)的影響

成 羿 董學(xué)亮 王 佩 杭州市中醫(yī)院 杭州 310007

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療骨骼肌損傷有獨(dú)特的療效。本實(shí)驗(yàn)觀察我院自制活血止痛膏劑外敷治療兔腓腸肌鈍挫傷，并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)兔IIb型肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、I型膠原、III型膠原mRNA的表達(dá)，探討活血止痛膏劑對(duì)骨骼肌修復(fù)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 活血止痛膏劑（主要藥物:片姜黃、赤芍藥等，由本院藥劑科提煉制成膏劑，高劑量組藥物濃度為臨床人體使用藥物濃度，中劑量組為高劑量組濃度的50%，低劑量組為高劑量組濃度的10%）。青鵬膏（藥物組成：棘豆、亞大黃、鐵棒錘、訶子、安息香、人工麝香等，西藏奇正藏藥股份有限公司，準(zhǔn)字號(hào)Z54020140）。

1.2 主要試劑 Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。2×Taq MasterMix（含染料）酶（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。100bp DNA Ladder Marker（TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)大白兔63只，平均體質(zhì)量（2.5±0.2）kg，雌雄各半。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)及取標(biāo)本皆在該中心完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0036。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 參照張靜[1]造模方法，并稍加改進(jìn)。將日本大耳白兔俯臥位固定在解剖臺(tái)上，在雙后肢褪毛，利用重力棒選定腓腸肌肌腹中段做為打擊中心（距跟骨6.5cm處）。將打擊棒放塑料管中，管下口垂直對(duì)準(zhǔn)打擊部位，重物自由落體下落導(dǎo)致一次打擊傷，造成腓腸肌急性挫傷模型。60只造模成功。隨機(jī)分為活血止痛膏高、中、低劑量組及青鵬膏對(duì)照組、外傷對(duì)照組，各12只。另取3只設(shè)為正常對(duì)照組?；钛雇锤喔鲃┝恐委熃M和青鵬膏組于傷后第一天取相應(yīng)膏劑外敷傷處，1天1次，每日更換。外傷對(duì)照組僅予紗布傷處包扎。各實(shí)驗(yàn)組分別在3、10、20、27天各處死兔子3只，取雙側(cè)腓腸肌標(biāo)本，共6個(gè)。正常對(duì)照組3只一次性處死取標(biāo)本。分別做RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性IIb型MHC、I型及III型膠原mRNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 檢索 NCB I GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中IIb型MHC、I型膠原、III型膠原全長(zhǎng)mRNA序列，應(yīng)用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)出IIb型MHC、I型膠原、III型膠基因以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，用SPASS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多組計(jì)量資料進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Ⅱb型MHC mRNA檢測(cè)結(jié)果 傷后第3、10、20、27天各實(shí)驗(yàn)組Ⅱb型MHC mRNA與正常組比較，均有升高（P＜0.05）；傷后第3、10、20天活血止痛膏中、高劑量組及青鵬膏組高于外傷組、活血止痛膏低劑量組（P＜0.05）。傷后第10天各實(shí)驗(yàn)組Ⅱb型MHC mRNA均達(dá)到峰值；傷后第10、20天中劑量組Ⅱb型MHC mRNA表達(dá)量低于高劑量組與青鵬膏組（P＜0.05）。傷后第27天各實(shí)驗(yàn)組Ⅱb型MHC mRNA降至實(shí)驗(yàn)階段最低，見表2、圖1。

表2 各組Ⅱb型MHCmRNA含量比較（±s）

表2 各組Ⅱb型MHCmRNA含量比較（±s）

注：與正常組比較，☆P＜0.05；與外傷組比較，△P＜0.05；與低劑量組比較，○P＜0.05；與中劑量組比較，◆P＜0.05

組 別正常組外傷組低劑量組中劑量組高劑量組青鵬膏組n/個(gè)6 6 6 6 6 6 3天0.418±0.100 0.600±0.110☆0.608±0.118☆0.795±0.184☆△○0.812±0.062☆△○0.803±0.130☆△○10天0.418±0.100 0.752±0.140☆0.763±0.104☆0.939±0.108☆△○1.115±0.089☆△○◆1.122±0.229☆△○◆20天0.418±0.100 0.661±0.077☆0.639±0.113☆0.834±0.020☆△○1.012±0.129☆△○◆0.986±0.074☆△○◆27天0.418±0.100 0.618±0.118☆0.618±0.110☆0.666±0.084☆0.684±0.046☆0.682±0.100☆

注：上一排為目的條帶，下一排為對(duì)應(yīng)內(nèi)參，從左到右泳道依次是：1為100bp DNA Ladder Marker；2為正常組；3～6為外傷對(duì)照組3天、10天、20天、27天，7～10為活血止痛膏劑高劑量組3天、10天、20天、27天；11～14為活血止痛膏劑中劑量組3天、10天、20天、27天；15～18為活血止痛膏劑低劑量組3天、10天、20天、27天。

2.2 Ⅰ型膠原mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)各組傷后第3天Ⅰ型膠原mRNA含量未見明顯增高；且各組之間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），傷后第10天Ⅰ型膠原mRNA各實(shí)驗(yàn)組都達(dá)到峰值；第10、20天各組表達(dá)量升高與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），活血止痛膏中、高劑量組、青鵬膏劑組表達(dá)低于外傷組和低劑量組（P＜0.05）；中劑量組表達(dá)高于高劑量組和青鵬膏組（P＜0.05）。第27天各實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原mRNA含量較第20天明顯降低，且趨于相同，但都高于正常組（P＜0.05），見表3、圖2。

表3 各組Ⅰ型膠原mRNA含量比較（±s）

表3 各組Ⅰ型膠原mRNA含量比較（±s）

注：與正常組比較，☆P＜0.05；與外傷組比較，△P＜0.05；與低劑量組比較, ○P＜0.05；與中劑量組比較，◆P＜0.05

組 別正常組外傷組低劑量組中劑量組高劑量組青鵬膏組n/個(gè)6 6 6 6 6 6 3天0.421±0.260 0.596±0.260 0.588±0.066 0.448±0.082 0.403±0.045 0.472±0.090 10天0.421±0.260 1.216±0.121☆1.273±0.113☆0.934±0.185☆△○0.712±0.089☆△○◆0.702±0.086☆△○◆20天0.421±0.260 1.092±0.167☆1.064±0.175☆0.854±0.126☆△○0.618±0.064☆△○◆0.621±0.128☆△○◆27天0.421±0.260 0.802±0.138☆0.659±0.139☆0.684±0.115☆0.627±0.116☆0.630±0.110☆

2.3 Ⅲ型膠原mRNA表達(dá) 各組傷后第3天Ⅲ型膠原mRNA有明顯增高，接近峰值，隨著藥物及濃度的不同，升高的幅度也不同。第10天達(dá)到峰值，但較第3天無明顯差異，第20天較第10天下降。第3、10、20天各組內(nèi)源性Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量高于正常組（P＜0.05）；活血止痛膏中、高劑量組、青鵬膏組表達(dá)量低于外傷組和低劑量組（P＜0.05）；中劑量組表達(dá)量高于高劑量組和青鵬膏組（P＜0.05）；高劑量組與青鵬膏劑組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第27天各實(shí)驗(yàn)組Ⅲ型膠原的mRNA含量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4 各組Ⅲ型膠原mRNA含量比較（±s）

表4 各組Ⅲ型膠原mRNA含量比較（±s）

注：與正常組比較，☆P＜0.05；與外傷組比較，△P＜0.05；與低劑量組比較，○P＜0.05；與中劑量組比較，◆P＜0.05

組 別正常組外傷組低劑量組中劑量組高劑量組青鵬組n/個(gè)6 6 6 6 6 6 3天0.504±0.099 1.314±0.129☆1.299±0.276☆0.980±0.261☆△○0.751±0.123☆△○◆0.749±0.123☆△○◆10天0.504±0.099 1.439±0.083☆1.459±0.161☆1.166±0.217☆△○0.805±0.122☆△○◆0.830±0.245☆△○◆20天0.504±0.099 1.337±0.102☆1.320±0.194☆1.072±0.173☆△○0.782±0.306☆△○◆0.794±0.265☆△○◆27天0.504±0.099 0.847±0.242☆0.847±0.254☆0.821±0.229☆0.778±0.273☆0.782±0.105☆

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，骨骼肌急性鈍挫傷后，筋肉或傷、或斷，絡(luò)脈隨之受傷，氣血互阻，血腫形成引起疼痛和功能障礙，治療以活血化瘀，行氣通絡(luò)，消腫止痛為主。“活血止痛膏劑”由片姜黃、赤芍藥、馬錢子等中藥組成。片姜黃破血行氣止痛，赤芍藥活血散瘀，涼血清熱均為君藥；馬錢子通經(jīng)絡(luò)，消結(jié)腫，止疼痛。諸藥合用共奏化血破瘀，退腫止痛，涼血清熱，預(yù)防瘀血化熱的功效。中藥治療軟組織損傷的機(jī)制包括：①抗?jié)B出：在損傷早期減少組織出血，抑制炎癥反應(yīng)。②改善微循環(huán)：修復(fù)微循環(huán)系統(tǒng)，加強(qiáng)受損組織對(duì)丟失和滲出細(xì)胞的吸收，有利于肌纖維修復(fù)愈合。③鎮(zhèn)痛解痙：通過鎮(zhèn)痛作用減輕受損組織的疼痛反應(yīng)，通過抗炎作用抑制損傷組織的局部炎性滲出、浸潤(rùn)，從而改善缺氧和代謝狀態(tài)；通過解痙作用松弛僵硬的肌肉組織，從而改善肌肉纖維的扭曲和紊亂，促進(jìn)損傷斷裂的肌肉纖維接近或合攏以及減少纖維性疤痕的產(chǎn)生。④抑制膠原纖維合成：防止結(jié)締組織過量增生，減少疤痕性愈合，增加肌細(xì)胞性修復(fù)。藥理研究證明，姜黃素是一種新型的抗氧化劑，可阻止丙酮醛/賴氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損害，并且可抑制丙酮醛誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞凋亡和活性氧的產(chǎn)生[2]。姜黃素對(duì)急性、亞急性和慢性炎癥具有抗炎作用。姜黃素對(duì)花生四烯酸代謝中的環(huán)氧合酶和脂氧合酶均有拮抗作用[3]。赤芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用、抗血小板凝聚作用。馬錢子及其氮氧化物有改善微循環(huán)、增加血流、抗血栓形成及抑制血小板聚集作用，馬錢子堿的劑量達(dá)到馬錢子堿氮氧化合物和阿司匹林的一半時(shí)，即有與馬錢子堿氮氧化合物和阿司匹林同樣作用[4]。馬錢子及其主要成分對(duì)整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有興奮作用，且具有明顯量效相關(guān)性，治療劑量以中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮為主，同時(shí)具有非成癮性鎮(zhèn)痛、抑制變態(tài)反應(yīng)性炎癥、抗凝、促進(jìn)循環(huán)等作用[5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察活血止痛膏治療急性骨骼肌鈍挫傷后，骨骼肌組織局部的IIb型MHC、I型及III型膠原mRNA的表達(dá)的影響。結(jié)果表明高劑量活血止痛膏能夠抑制膠原合成，促進(jìn)骨骼肌蛋白合成，其作用與青鵬膏相當(dāng)。

［1］張靜，趙斌.按摩對(duì)兔骨骼肌挫傷后修復(fù)作用的研究［D］.河北師范大學(xué)，2003.

［2］ChanWH，Wu HJ.Protective effectsof curcumin onmethylglyoxal-induced Oxidative DNA damage and cell injury in human mononuclear cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27（9）：1192-1198.

［3］Hammamieh R，Sumaida D，Zhang X，et al.Control of the growth of human breast cancer cells in culture bymanipulation of arachidonate metabolism［J］.BMC Cancer，2007，7:138.

［4］周建英，卞慧敏，馬聘，等.馬錢子堿和馬錢子堿氮氧化物抗血小板聚集及抗血栓形成作用的研究［J］.江蘇中醫(yī)，1998，19（4）:41.

［5］胡錫琴，郭翠華.馬錢子研究述要［J］.陜西中醫(yī)，2005，26（11）:1229.