MPEG-PLGA納米膠囊在真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的應(yīng)用

涂心明，郭紹芳，胡伊樂

基因治療是近些年來興起的通過植入外源性治療基因片段，治療各種基因缺陷性疾病的一種新型疾病治療方法?；蛑委煏r(shí)需將治療性目的基因片段插入真核質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞，通過目的基因在體內(nèi)的表達(dá)糾正某些基因缺陷，以達(dá)到治療疾病的目的[1]。由于大多數(shù)治療用真核質(zhì)粒攜帶負(fù)電荷與細(xì)胞膜自身電荷相同，靜電排斥作用使自然情況下裸質(zhì)粒穿越細(xì)胞膜的幾率較低，很難達(dá)到治療濃度[2]。為增加真核質(zhì)粒穿越細(xì)胞膜的幾率，目前常用的方法有增加細(xì)胞膜通透性的氯化鈣、電擊、基因槍等方法[3]，由于對機(jī)體細(xì)胞有損傷，多用于實(shí)驗(yàn)研究，臨床應(yīng)用較少。MPEG-PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)是一類可降解的功能高分子有機(jī)聚合物, 通過美國 FDA認(rèn)證, 具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性、無免疫原性和藥物緩釋等特性[4], 在臨床與科研中作為化學(xué)類藥物的給藥載體得到廣泛應(yīng)用，作為真核質(zhì)粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用MPEG-PLGA包裹綠色熒光真核質(zhì)粒，通過綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)驗(yàn)證其作為真核質(zhì)粒跨膜載體的可行性。

1 材料與方法

1.1材料MPEG-PLGA購自山東濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司；四季青胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自上海寶生物生物有限公司；pEGFP-C3綠色熒光真核質(zhì)粒與NIH3T3細(xì)胞由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、凍存管購自鄭州天根生物有限公司。

1.2方法

1.2.1 溶液的配制 ①M(fèi)PEG-PLGA水溶液的制備：用三角瓶取雙蒸水20 mL，牛皮紙封口后高溫蒸汽消毒，待自然冷卻后置4℃冰箱過夜以備用，無菌環(huán)境下稱取MPEG-PLGA 300 mg，加入已消毒的4℃雙蒸水中，將三角瓶置于冰水混合物中震蕩使其溶解。待溶解完全后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。②MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物的配制：取260 pg/mL的質(zhì)粒300 μl加入到1 mL上述配制的MPEG-PLGA溶液中在冰水混合物中混勻，在此過程中盡量輕柔以防止破壞質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，室溫放置15 min，置37℃恒溫箱中30 min,即可得到包裹pEGFP-C3的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物。

1.2.2 復(fù)合物粒徑檢測 用Malvern粒度測定儀測其MPEG-PLGA/ pEGFP-C3復(fù)合物的粒徑。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) ①細(xì)胞準(zhǔn)備：液氮保存的細(xì)胞由于很多機(jī)能處于休眠狀態(tài)，為獲取理想的細(xì)胞活性，液氮中凍存的NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇后需傳3代以便細(xì)胞恢復(fù)正?；盍Γ^察細(xì)胞的形態(tài)與機(jī)能恢復(fù)正常后轉(zhuǎn)入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部達(dá)75%時(shí)將其分為2組，每組9孔細(xì)胞準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取去內(nèi)毒素的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物加入第1組培養(yǎng)孔中；將pEGFP-C3裸質(zhì)粒加入第2組培養(yǎng)孔中以對照，將兩組混勻后靜置15 min，然后在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。③觀察與陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)：培養(yǎng)48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，每孔在40倍視野下隨即選取6個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中顯示綠色熒光的陽性細(xì)胞的數(shù)量，取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物的粒徑測定結(jié)果如圖1所示，納米粒粒徑呈單式正態(tài)分布，平均粒徑為28.3 nm，多分散系數(shù)為0.21，表明納米粒大小較均勻，分布范圍窄。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果熒光顯微鏡下觀察可見，轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，48 h達(dá)高峰，兩組結(jié)果見圖2。裸質(zhì)粒組不但熒光表達(dá)弱且僅有少量陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率不足3%，MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物組陽性細(xì)胞達(dá)15.3%，熒光表達(dá)強(qiáng)。結(jié)果證明MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于裸質(zhì)粒。

圖1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物粒徑

圖2 兩組轉(zhuǎn)染效果對比圖

3 討論

MPEG-PLGA由乳酸和羥基乙酸兩種單體聚合而成,具有良好的生物相容性,無毒、無刺激、無免疫原性和藥物緩釋等特性，特別是具有很好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)生物相容性，分子量0.5～20萬[5]，常作為一些水溶性差、自身性質(zhì)不穩(wěn)定、體內(nèi)代謝快、生物利用度低類化學(xué)藥物的給藥載體，在應(yīng)用中大多采用溶劑揮發(fā)法或透析法等制備微粒膠囊，這些方法大都涉及到二氯甲烷、乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑的使用，殘留的有機(jī)溶劑不僅對人體具有很大危害，導(dǎo)致副作用的發(fā)生，而且容易破壞目的基因片段中DNA之間的鏈接，使其發(fā)生斷裂，在基因治療過程中不能正確表達(dá)治療蛋白。為了解決這一問題，本試驗(yàn)利用共聚物比聚乳酸具有更大的親水性，并且具有溫敏水凝膠的特性(即其水溶液在4℃時(shí)完全溶于水，在37℃時(shí)變?yōu)樗z[6])提出了一種新型制備納米膠囊的方法——直接溶解法。該方法將MPEG-PLGA溶解于4℃的雙蒸水中，加入真核質(zhì)?；旌虾笾饾u升溫至37℃，利用溫敏水凝膠的特性使其在形成凝膠顆粒時(shí)包裹游離在水溶液中的真核質(zhì)粒，形成具有良好生物相容性的MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物，該復(fù)合物穿越細(xì)胞膜后MPEG-PLGA凝膠顆粒在機(jī)體一些催化酶的作用下很快溶解釋放出真核質(zhì)粒，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋白從而起到治療疾病的目的，此方法在微粒膠囊制備時(shí)沒有劇烈的震蕩和有機(jī)溶劑的參與，可有效保護(hù)目的基因片段的完整性。本試驗(yàn)中利用細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)觀察MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。試驗(yàn)結(jié)果顯示MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物組轉(zhuǎn)染效率(15.3%)明顯高于作為對照的裸質(zhì)粒組(3%)，證明利用MPEG-PLGA包裹真核質(zhì)?？捎行岣咂滢D(zhuǎn)染效率，另外根據(jù)MPEG-PLGA的特性，可通過改變聚合物單體比例和分子量，調(diào)控共聚物在體內(nèi)的降解速度、DNA包封率以及基因體內(nèi)釋放速度。試驗(yàn)結(jié)果表明MPEG-PLGA可以作為一種新型跨膜載體在臨床與研究中得以應(yīng)用。

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