廢棄蓖麻基潤滑油高效降解菌的分離與鑒定

劉亞瓊，王昌祿，李風(fēng)娟，葉 峰

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 南開大學(xué)蓖麻工程研究中心，天津 300071)

隨著人類環(huán)保意識的提高，人們已開始關(guān)注潤滑油可能造成的環(huán)境污染．石油的開采、運輸、加工、儲藏等人為活動的進(jìn)行，使得石油及石油產(chǎn)品成為土壤有機(jī)污染的重要因素．在油井附近，石油類污染物含量平均達(dá)到 15.8,g/kg，而農(nóng)田中的含量僅為 2.2,mg/kg[1]，全世界每年約有10億噸石油及其產(chǎn)品通過各種途徑進(jìn)入地下水、地表水及土壤中[2–3]．隨著全球潤滑油消耗量逐漸增加，對環(huán)境的污染日趨加劇，污染物嚴(yán)重影響人類及其他生物的生存健康[4–5].目前，大多數(shù)研究通過添加 N、P[6]等營養(yǎng)物質(zhì)改善土著微生物的活性，但受環(huán)境影響，土著微生物生長緩慢，使環(huán)境修復(fù)受到一定限制．向環(huán)境中投加適應(yīng)強、降解效能高的菌種或菌群是提高石油污染土壤生物修復(fù)效率的主要手段[7–9]，開發(fā)可生物降解潤滑油并對潤滑油進(jìn)行生物降解可行性評價已經(jīng)成為潤滑油行業(yè)發(fā)展的必然趨勢[10]．

蓖麻基潤滑油是以蓖麻油為主要原料合成的一種新型潤滑油，在使用過程中是否可生物降解以及對環(huán)境造成污染的程度是企業(yè)關(guān)注的熱點．目前，國際上已建立了多種有機(jī)物生物降解性的測定方法[11–15]，如通過檢測 CO2的生成量來評價其生物降解能力的STURM 法[12]；以 BOD5/CODCr為度量指標(biāo)，檢測生物降解過程中 O2消耗量的 MITI法[12]；以生物降解前后油品含量的變化為其度量指標(biāo)的 CEC-L-33-A-93法[13–14]以及其他實驗方法[15]．在借鑒這些常用生物降解方法的基礎(chǔ)上，本文采用氣相色譜法(GC)，通過添加內(nèi)標(biāo)物，定量分析廢棄蓖麻基潤滑油的殘余量，計算廢棄蓖麻基潤滑油的降解率，既而從蓖麻榨油車間排污口處分離到對廢棄蓖麻基潤滑油具有降解特性的菌株．

1 材料與方法

1.1 樣品來源及培養(yǎng)基

從內(nèi)蒙古某蓖麻榨油車間排污口采取土樣和水樣；廢棄蓖麻基潤滑油由南開大學(xué)蓖麻工程研究中心提供．

礦物降解培養(yǎng)基：KH2PO43.4,g，Na2HPO41.5,g，(NH4)2SO44.0,g，MgSO40.7,g，NaCl 1.6,g，酵母粉0.01,g，吐溫 80 0.6,mL，蓖麻基潤滑油 5.0,mL，自來水 1,L，pH 7.0～7.2，121,℃滅菌 20,min．

富集培養(yǎng)基：葡萄糖 3,g，NaCl 5,g，酵母膏 3,g，蛋白胨 3,g，K2HPO4·3H2O 2.7,g，自來水 1,L，pH 7.2，115,℃滅菌 15,min．

麥芽汁培養(yǎng)基：將麥芽粉與水以質(zhì)量比為 1﹕4混合，在 65,℃水浴鍋中保溫 3～4,h，使其自行糖化，直至糖度為 12,Brix，糖化液用 4～6層紗布過濾，濾液如仍混濁，可用雞蛋清澄清(用 1個雞蛋清，加水20,mL，調(diào)勻至生泡沫，倒入糖化液中，攪拌煮沸，再過濾)．

PDA培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200,g，切成小塊，加入 1,L自來水煮沸 30,min，用雙層紗布濾成清液．加水至 1,L，加入 20,g葡萄糖完全溶解，pH 自然．固體培養(yǎng)基加瓊脂20,g．121,℃滅菌15,min．

1.2 降解菌的分離篩選

在無菌條件下，取少量樣品，加入 50,mL無菌水?dāng)嚢?，制成懸浮液，移?0.1,mL懸浮液，放入以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器連續(xù)涂布 4個平板，置于 30,℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3,d，挑取生長較快且不同菌落形態(tài)的菌株，進(jìn)一步分離純化復(fù)篩．從中篩選出能以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源生長的菌株．

1.3 培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

配制初始 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的 PDA 培養(yǎng)基，滅菌后用無菌水沖洗試管斜面，將沖洗的孢子混勻后按 3%的量加入到不同初始 pH的 PDA培養(yǎng)基中．培養(yǎng) 3,d后觀察菌株生長狀況，過濾后在 80,℃鼓風(fēng)烘箱中烘干菌絲體至恒質(zhì)量，稱取菌絲體．同理，在不同培養(yǎng)溫度：15、20、25、30、35、40,℃的培養(yǎng)環(huán)境中，180,r/min，培養(yǎng)48,h后，測定不同培養(yǎng)溫度時生物量，確定最適生長溫度．稱取 0.5、1、2、4、6、8、10、12,g 廢棄蓖麻基潤滑油分別加入 100,mL的礦物培養(yǎng)基中，30,℃、培養(yǎng)12,d后觀察各瓶生長情況．

1.4 菌落形態(tài)觀察

在麥芽汁和 PDA平板培養(yǎng)基中觀察菌株 M-4的菌落特征，并用電鏡掃描觀察其菌絲體孢子形態(tài)，初步確定菌株的分類．

1.5 18S,rDNA基因擴(kuò)增及序列分析

采用CTAB法提取菌株M-4總DNA，利用真菌18,S rDNA擴(kuò)增通用引物 F1(GTAGTCATATGC TTGTCTC)和R1(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增．25,μL反應(yīng)體系中含有：10×PCR緩沖液 2.5,μL，50,mmol/L 的 MgCl20.8,μL，10,mmol/L的 dNTP 0.5,μL，引物各 0.5,μL，5,U/μL 的 Taq DNA聚合酶 0.2,μL，模板 DNA 1,μL，加無菌雙蒸水補至25,μL．PCR 反應(yīng)條件為：94,℃變性 5,min，55,℃退火30,s，72,℃延伸 1,min，30個循環(huán)后 72,℃溫育10,min，4,℃保存?zhèn)溆茫當(dāng)U增產(chǎn)物通過 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在凝膠成像儀上觀察并記錄結(jié)果，得到條帶清晰的片段后進(jìn)行切膠，用Axygen 凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化．

擴(kuò)增后的 18S rDNA純化后由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，測得的序列提交到GenBank并在國際生物技術(shù)信息網(wǎng)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行序列同源性分析，使用Clustal X1.8軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的18S rDNA序列進(jìn)行多序列比較，Mega 4.0軟件中NJ法(鄰接法)構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap檢驗，重復(fù)1,000次，確定該菌株的分類．

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取 10.0、30.0、50.0、70.0、90.0,mg 的廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油及 50.0,mg聯(lián)苯置于 10,mL容量瓶中，用聯(lián)苯作內(nèi)標(biāo)物，乙酸乙酯作溶劑．萃取物用GC進(jìn)行分析：采用火焰離子化檢測器(FID)，Rtx-5 的二氧化硅柱．分析條件：初始溫度為 50,℃，保持5,min，然后以20,℃/min 升溫至 280,℃，保持 40,min．進(jìn)樣器和檢測器的溫度都維持在 280,℃，進(jìn)樣 1,μL，用氮氣作載氣．以聯(lián)苯與基礎(chǔ)油的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.7 廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油降解實驗

將菌株 M-4活化后進(jìn)行廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的生物降解，從種子培養(yǎng)基中吸取 1,mL種子液，接種到已滅菌的含廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的錐形瓶中，準(zhǔn)確稱取每瓶加入的廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油，30,℃、180,r/min遮光振蕩培養(yǎng) 7,d，取出培養(yǎng)液，10 000,r/min離心10,min，取上清液，加入1,mol/L的HCl約 1,mL和 NaCl 20,g，振蕩，待 NaCl完全溶解后，采用超聲波細(xì)胞破碎儀將培養(yǎng)基中的微生物細(xì)胞壁破碎，使內(nèi)容物釋放及進(jìn)一步破乳．用乙酸乙酯作萃取劑萃取3次，每次用量30,mL，劇振2,min，靜置分層，收集萃取液上層有機(jī)相，放入三角瓶中，在萃取后90,mL的萃取液中加入500,mg聯(lián)苯，作為內(nèi)標(biāo)物．按照1.6的條件進(jìn)行GC分析．

式中：m基剩為剩余基礎(chǔ)油的質(zhì)量；m聯(lián)苯為聯(lián)苯的質(zhì)量；m基為基礎(chǔ)油的質(zhì)量；A聯(lián)苯為聯(lián)苯的峰面積；A基剩為剩余基礎(chǔ)油的峰面積；w為降解率．

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解菌的篩選

從內(nèi)蒙某蓖麻榨油廠排污口采取土樣和水樣，經(jīng)富集培養(yǎng)及分離純化，篩選出 25株菌株，經(jīng)過潤滑油降解實驗誘導(dǎo)馴化后選取能在廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源培養(yǎng)基上生長較好的菌株M-4．

2.2 菌落形態(tài)觀察

菌株 M-4的菌落特征如圖 1所示，菌絲體孢子形態(tài)見圖2．

由圖 1和圖 2可以看出，在麥芽汁培養(yǎng)基上，30,℃培養(yǎng) 4,d，菌株 M-4的菌落直徑達(dá) 20,mm，表面毛絨狀，菌絲致密交錯，分生孢子梗先白色然后四周開始變成褐色，而 PDA培養(yǎng)基的生長狀態(tài)基本與麥芽汁培養(yǎng)基上生長狀態(tài)一致．

圖1 菌株M-4菌落形態(tài)Fig. 1 Colonial morphology of M-4 strain

圖2 菌株M-4電鏡掃描圖Fig. 2 Scanning map of M-4 strain under electron microscope

2.3 菌株M-4的18S rDNA序列分析

以菌株 M-4提取的 DNA為模板，擴(kuò)增其 18S rDNA基因序列，得到長約1,500,bp的18S rDNA片段，如圖 3所示．?dāng)U增片段經(jīng)測序后，測得其長度為1,675,bp，其 GenBank 序列號為 HM165489.1．

圖3 菌株M-4的18S rDNA片段擴(kuò)增電泳圖譜Fig. 3 18S rDNA fragments amplified by electrophoresis of M-4 strain

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將菌株M-4的基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行 Blast比對，其序列與鏈格孢屬(Alternaria alternata)同源性達(dá)99%，選取11株同源性較高的菌株序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示．由18S rDNA基因序列比對可知，菌株 M-4與 Alternaria alternata親緣關(guān)系最接近，結(jié)合菌落形態(tài)觀察，菌株M-4鑒定為鏈格孢屬(Alternaria alternata)．

圖4 菌株M-4 18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree constructed by18S rDNA gene sequence of M-4 strain

2.5 培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

2.5.1 最適pH

在其他條件一致的情況下，培養(yǎng)基的初始 pH對菌株 M-4的生長有較大影響．在不同 pH下，菌株M-4生長狀態(tài)、菌絲體形狀、發(fā)酵產(chǎn)物顏色等都不同．觀察發(fā)現(xiàn)，pH 2和pH 10的培養(yǎng)瓶都不生長；pH 3的生長較慢，呈小球狀；pH 9的培養(yǎng)基呈渾濁狀態(tài)，菌絲體呈小球狀；其余 pH條件下的菌株生長液呈黑色黏稠狀；pH 5、pH 7的顏色較深；pH 6的培養(yǎng)基中菌體呈團(tuán)，培養(yǎng)液澄清．將培養(yǎng)3,d不同初始pH的菌株 M-4進(jìn)行過濾烘干至恒質(zhì)量后稱取菌體，初始pH對菌株M-4生長的影響如圖5所示．菌株M-4在酸、堿性條件下都能適應(yīng)并生長，最適pH為5.0．

圖5 初始pH對菌株M-4生長的影響Fig. 5 Effect of initial pH on the growth of M-4 strain

2.5.2 最適溫度

隨著溫度的上升，細(xì)胞中的生化反應(yīng)速率和生長速率加快；另一方面，機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸和催化反應(yīng)的酶等對溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度的破壞．因此，選擇合適的溫度對菌株性能至關(guān)重要．溫度還影響酶活力，在適宜溫度下，產(chǎn)酶量增加，酶的活力提高，菌株降解能力增強[16]．

培養(yǎng)溫度對菌株 M-4生長的影響如圖 6所示．從圖 6可以看出，菌株 M-4在 30,℃時生物量最高．

圖6 溫度對菌株M-4生長的影響Fig. 6 Effect of temperature on the growth of M-4 strain

2.5.3 潤滑油極限含量

潤滑油降解過程中主要依靠微生物對底物的一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)過程來達(dá)到降解目的．圖7為菌株 M-4在不同潤滑油含量的培養(yǎng)基中降解 7,d后的生長情況．

圖7 菌株 M-4在不同廢棄蓖麻基潤滑油含量的培養(yǎng)基中的生長情況Fig. 7 Growth condition of M-4 strain at different concentrations of waste castor-based lubricants

從圖 7可以看出，菌株 M-4在含廢棄蓖麻基潤滑油12%的礦物培養(yǎng)基中生長良好，將廢棄蓖麻基潤滑油直接降解變成黏稠的泥狀．表明該菌株在富含廢棄蓖麻基潤滑油的環(huán)境中生長旺盛，可為實際生態(tài)修復(fù)提供參考．

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.6方法繪制廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 8)，求出線性回歸方程 y＝1.477,4x＋0.185,2，相關(guān)系數(shù) R2＝0.999,4．以聯(lián)苯與基礎(chǔ)油的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

圖8 蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 8 Standard curve of base oil of castor-based lubricants

2.7 廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油降解后GC分析

根據(jù)廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)標(biāo)物(聯(lián)苯)計算廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油殘余量．

廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油降解后萃取的有機(jī)相用 GC進(jìn)行分析(圖 9)，樣品中只檢測到溶劑峰，聯(lián)苯峰和廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油峰，分別出現(xiàn)在保留時間為 3、12、21,min處．根據(jù)聯(lián)苯的質(zhì)量和峰面積計算殘余廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油和降解的廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油質(zhì)量，結(jié)果見表1．

圖9 菌株M-4降解廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的GC圖Fig. 9 GC map of the base oil of waste castor-based lubricants after degradation by M-4 strain

表1 菌株M-4對廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的降解情況Tab.1 Degradation rate of the base oil of waste castor-based lubricants

從表1可以看出，菌株M-4對廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油降解率為71.3%．

3 結(jié) 論

利用廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的礦物培養(yǎng)基，采用平板梯度連續(xù)涂布法，從內(nèi)蒙古蓖麻榨油車間排污口分離篩選到一株高效降解菌M-4，通過對該菌株生理生化特性、18S rDNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，菌株M-4鑒定為鏈格孢屬．

此外，對菌株M-4培養(yǎng)特性的研究表明，在不同初始pH和培養(yǎng)溫度下，菌株M-4生長狀況不同，影響較大．在其他條件一致時，廢棄蓖麻基潤滑油含量不同，菌株M-4的生長情況不同，在含廢棄蓖麻基潤滑油 12%的礦物培養(yǎng)基中，菌株仍能較好地生長，將廢棄蓖麻基潤滑油直接降解變成黏稠多孔的泥狀，為生態(tài)環(huán)境的實地修復(fù)提供了參考．

在廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油中加入 M-4菌液培養(yǎng)7,d后，降解率達(dá)到71.3%．采用GC方法，檢測廢棄蓖麻基潤滑油基礎(chǔ)油的降解產(chǎn)物，未出現(xiàn)其他中間代謝產(chǎn)物，表明廢棄蓖麻基潤滑油的基礎(chǔ)油主要成分更容易被微生物降解．

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