聚（NIPAAM－EDMA）整體柱的制備及其對尿樣中氫化可的松的富集分析

賈艷花，劉海燕，楊寧，段艷慧，楊更亮

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002）

聚（NIPAAM－EDMA）整體柱的制備及其對尿樣中氫化可的松的富集分析

賈艷花，劉海燕，楊寧，段艷慧，楊更亮

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002）

以N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAM）為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，制備了一種能有效去除尿樣中的大分子物質(zhì)，并能同時(shí)富集尿樣中氫化可的松的整體柱.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氫化可的松在5～30 mg／L線性關(guān)系良好（R＝0.999 3，n＝6），檢測限為0.012 mg／L；絕對回收率79%～83%；日內(nèi)、日間精密度均＜5.0%，整體柱能夠很好地富集尿樣中的氫化可的松，并且能很好地除去尿樣中的大分子物質(zhì)及雜質(zhì)，能滿足分析的要求.

N－異丙基丙烯酰胺；整體柱；富集分析；氫化可的松

整體柱又稱為棒狀柱、連續(xù)床層、無柱塞柱，是一種用有機(jī)或無機(jī)聚合方法在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相，作為一種新型的分離介質(zhì)已經(jīng)用在液相色譜和毛細(xì)管色譜上［1－2］.自20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)以來，合成了不同種類的整體柱新型材料，并通過在固定相上做不同的衍生制備了很多具有功能性的整體柱.氫化可的松是天然的皮質(zhì)激素類的藥物，有抗炎、抗毒、抗休克的作用.目前人們對樣品中氫化可的松及其他激素類藥物的分析主要是高效液相色譜法［3－4］、反向流動注射－化學(xué)發(fā)光法［5］、高效液相色譜－質(zhì)譜法［6］、氣相色譜法－質(zhì)譜法［7］等，但均操作較復(fù)雜，過程較繁瑣.本實(shí)驗(yàn)以N－異丙基丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑，制備了一種新型整體柱材料，整體柱做為尿樣中氫化可的松的富集柱，能夠除去尿樣中的生物大分子物質(zhì)和尿樣中其他成分的干擾，對氫化可的松有很好的保留，實(shí)現(xiàn)對氫化可的松的快速、簡便、有效富集，并聯(lián)合C18柱進(jìn)行分析測定.

圖1 氫化可的松的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of hydrocortisone

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：P3000高效液相色譜儀（中國，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；UV－3000紫外／可見分光檢測器（中國，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；色譜工作站CXT H－3000（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；不銹鋼空色譜柱管（10 mm×4.6 mm i.d.）；SZ－97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；HH－601超級恒溫水?。ńK省金壇市榮華儀器制造有限公司）.

N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAM，分析純，日本Tokyo Kasei Kogyo公司），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析純，美國acros公司），十六醇（分析純，天津天泰化工精細(xì)化學(xué)品有限公司），偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，上海試劑四赫維化有限公司），甲醇（分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；尿液由健康志愿者提供.

1.2 整體柱的制備

將NIPAAM（0.075 g），EDMA（0.7 m L），AIBN（0.003 g），十六醇（0.045 g），甲醇（1.3 m L）依次加入到試管中，經(jīng)混合、超聲、通氮?dú)?0 min，轉(zhuǎn)移到干凈、干燥的不銹鋼色譜柱管中，抽真空20 min密封，在60℃恒溫的條件下反應(yīng)24 h.將取出的柱體放至常溫后，分別用甲醇和水沖柱，將柱中的殘余的致孔劑和其他可溶性的物質(zhì)除去，即可得到整體柱.

1.3 樣品的制備

精密稱取適量的氫化可的松制備成1.0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液（放于冰箱中保存），用于配制5～30 mg／L的尿液樣品.

1.4 色譜分析的條件

富集柱：自制整體柱；流動相：水；流速：1.0 m L／min；檢測波長280 nm.

分析柱：C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；流動相：甲醇－水（V（甲醇）∶V（水）＝60∶40）；流速1.0 m L／min；檢測波長245 nm.

1.5 樣品處理與色譜分析

將自制整體柱連接在高效液相色譜儀上，按照1.4節(jié)色譜條件，即先在280 nm處連接整體柱對尿樣中的藥物進(jìn)行富集，富集完全后停泵，將C18柱與整體柱連接，在245 nm下進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱的表征

2.1.1 柱壓和流速的關(guān)系

分別以甲醇和水為流動相考察了整體柱的柱壓降與流速的關(guān)系，從圖2可以看出柱壓降與流速呈良好的線性關(guān)系，隨著流速的增加，柱背壓呈現(xiàn)線性的變化，以甲醇為流動相，當(dāng)流速為3 m L／min時(shí)，柱背壓為2.3 MPa，結(jié)合圖3可看出整體柱的骨架結(jié)構(gòu)中具有大小不等的微孔，所以整體柱具有良好的通透性.

圖2 整體柱柱壓降與流速的關(guān)系Fig.2 Effect of flow rate on back pressure

2.1.2 掃描電鏡

圖3為整體柱的電鏡圖，聚合物的結(jié)構(gòu)是由球形束和束間不規(guī)則的孔組成，束間孔相互貫通，可以通過流動相，為固相萃取提供比較大的表面積，而且也可用于高流速分析.

圖3 整體柱的電鏡Fig.3 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.1.3 紅外圖譜

由紅外圖譜4看出，3 100 cm－1附近的－C＝C－上特征峰消失，在1 180 cm－1處的酯鍵中－C－O－基的吸收峰在連接上EDMA后明顯地增強(qiáng)，在1 680 cm－1處－C＝O的吸收峰明顯增強(qiáng).

圖4 整體柱的紅外譜Fig.4 FT－IR spectra of monolithic column

2.2 氫化可的松的富集及分析

2.2.1 流動相對藥物保留的影響

以水為流動相，以整體柱為色譜柱，取適量氫化可的松進(jìn)樣，如色譜圖5b；在同樣條件下將等量的氫化可的松以空柱管為柱體進(jìn)樣，如圖5a.從圖中可以看出以水為流動相時(shí)藥物保留強(qiáng)，基本不出峰，而空柱管出峰比較大，因此，以水做流動相可以很好地將藥物富集在整體柱上.

圖5 氫化可的松上樣于空柱管和整體柱Fig.5 Solution of Hydrocortisone injected into the connecting tube and the monolithic column

2.2.2 尿樣洗脫

以水為流動相，將5μL的空白尿樣直接進(jìn)入整體柱，從圖6中可以看出尿樣在3 min之內(nèi)出峰完畢.

圖6 空白尿樣洗脫色譜Fig.6 Chromatograms obtained from blank urine eluting

2.2.3 藥物的分析

按照1.5的操作，分別將5μL含有氫化可的松的尿樣和空白尿樣進(jìn)樣，以水為流動相時(shí)，樣品通過整體柱富集，富集完全后，停泵；在儀器穩(wěn)定后，串聯(lián)C18柱進(jìn)行分析，將整體柱上富集的氫化可的松洗脫下來（色譜圖見圖7）.

圖7 空白尿樣和氫化可的松的色譜Fig.7 Chromatograms obtained from blank urine and urine spiked with hydrocortisone

從圖7可以看出，空白尿樣（圖7a）在藥物出峰的位置沒有雜峰出現(xiàn)，尿樣并不影響藥物的分析，而含有氫化可的松的尿樣（圖7b）在5.2 min處出現(xiàn)藥物峰，因此可用來對氫化可的松的富集分析.

2.3 方法性能指標(biāo)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用尿液依次稀釋制備為質(zhì)量濃度5，10，15，20，25，30 mg／L系列溶液.按照1.5節(jié)的操作，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣品3次.以色譜峰面積Y對血藥質(zhì)量濃度X（mg／L）作圖，回歸方程為Y＝1.8691×103X－52.4，r＝0.999 3（n＝6），在5～30 mg／L內(nèi)具有良好的線性.當(dāng)儀器的信噪比（S／N）為3時(shí)，測得氫化可的松的檢測限0.012 mg／L.

2.3.2 精密度和回收率

準(zhǔn)確配制氫化可的松5，15，30 mg／L 3種質(zhì)量濃度尿液樣品和同質(zhì)量濃度的對照液各5份，尿液樣品按照1.5節(jié)的過程進(jìn)樣分析，對照液直接進(jìn)C18柱分析.用上面所得的值計(jì)算日內(nèi)、日間精密度及其回收率、絕對回收率.具體結(jié)果見表1.

表1 尿樣中氫化可的松的精密度、回收率、準(zhǔn)確度Tab.1 Precision accuracy and recovery of hydrocortisone in urine sample

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用自制的整體柱作為富集柱，能夠除去尿樣中的大分子，尿樣無需處理可以直接進(jìn)樣，避免了生物樣品繁瑣的預(yù)處理過程.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有良好的線性范圍、回收率和精密度，能夠滿足生物樣品分析測定的要求，本整體柱制備簡單，重復(fù)利用，成本低廉，為檢測樣品中痕量藥物的簡便、快速、有效方法.

［1］J SCOTT MELLORS，JAMES W JORGENSON.Use of 1.5μm porous ethyl－bridged hybrid particles as a stationary phase support for reversed－phase ultrahigh－pressure liquid chromatography［J］.Anal Chem，2004，76（18）：5441－5450.

［2］GUIOCHON G.Monolithic columns in high－performance liquid chromatography［J］.Chromatogr A，2007，1168：101－168.

［3］陳永紅，葉蔚云.高效液相色譜法測定食品中甾體激素殘留量的方法研究［J］.中國公共衛(wèi)生，1997，13（11）：696－697.

CHEN Yonghong，YE Weiyun.Determination of the residue steroid hormones in food by HPLC［J］.Chinese Journal of Public Health，1997，13（11）：696－697.

［4］饒艷輝，胡虹，周學(xué)琴.高效液相色譜法測定血液中丙酸倍氯米松的含量［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2008，10（2）：41－42

RAO Yanhui，HU Hong，ZHOU Xueqin.Determination of the content of beclomethasone dipropionate in blood by HPLC［J］.Modern Medicine Journal of China，2008，10（2）：41－42.

［5］范順利，李薇，林金明，等.反相流動注射－化學(xué)發(fā)光法測定氫化可的松［J］.分析化學(xué)，2004，32（11）：1421－1425.

FAN Shunli，LI Wei，LIN Jinming，et al.Reverse flow injection chemiluminescence determination of hydrocortisone）［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2004，32（11）：1421－1425.

［6］賀利民，黃顯會，方炳虎，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物肌肉組織和雞蛋中殘留11種甾體激素類藥物［J］.色譜，2008，26（6）：714－719.

HE Limin，HUANG Xianhui，F(xiàn)ANG Binghu，et al.Determination of eleven steroid hormones in animal muscle tissues and eggs using ultra－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chromatography，2008，26（6）：714－719.

［7］S IMPENS，J VAN LOCO，J M DEGROPEAN，et al.A downscaled multi－residue strategy for detection of anabolic steroids in bovine urine using gas chromatography tandem mass spectrometry（GC－MS3）［J］.Analytica Chimica Acta，2007，586：43－48.

Preparation of poly（NIPAAM－EDMA）monolithic column for enriching and analyzing hydrocortisone from urine

JIA Yan－h(huán)ua，LIU Hai－yan，YANG Ning，DUAN Yan－h(huán)ui，YANG Geng－liang
（College of Pharmacy，Hebei University，Baoding 071002，China）

A new monolithic column have been prepared which was composed of copolymer that theN－isopropylacrylamide（N－IPAAM）was the monomer and the ethyleneglycoldimethacrylate（EDMA）was the cross－linker.The monolith was used for removing the macromoleculer and enriching the hydrocortisone in urine sample.The result showed that hydrocortisone had a good linear（R＝0.999 3，n＝6）when the concentration of the hydrocortisone in the range of 5－30 mg／L，the limit of detection（LOD）was 0.012 mg／L.The absolutely recovery was 79%－83%.The inter－day RSD and intra－day RSD was less than 5%.This method is conforming to analysis.

N－isopropylacrylamide；monolithic column；enrichment analysis；hydrocortisone

R917

A

1000－1565（2012）02－0154－05

2011－10－20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21175031），河北省科技廳資助項(xiàng)目（11966411D）；河北省教育廳資助項(xiàng)目（2008416，ZD2010234）；科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十二五”計(jì)劃第二批課題（2012ZX09103－101－057）；河北大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2009－165）.42

賈艷花（1984－），女，河北行唐人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.

劉海燕（1971－），女，河北保定人，河北大學(xué)副教授，主要從事色譜分離材料的制備及應(yīng)用研究.

E－mail：lhy1610＠126.com

梁俊紅）