骨膜瓣復(fù)合異體骨移植修復(fù)大段骨缺損

張大偉 田清業(yè) 劉光軍 劉雪濤 王謙 楊磊

高能量損傷、腫瘤切除及先天畸形都可引起四肢長骨的大段缺損。大段骨缺損常用自體骨和異體骨移植治療。無論是自體骨移植還是異體骨移植，大段移植骨中部爬行替代緩慢，極易出現(xiàn)骨溶解吸收、骨折等并發(fā)癥。較理想的方法是自體骨瓣移植，但自體骨瓣因骨量有限，臨床應(yīng)用受到限制。近年來有報(bào)道使用帶血管骨膜瓣復(fù)合異體骨移植的手術(shù)方法，該類方法中較經(jīng)典的是帶血管腓骨瓣復(fù)合大段異體骨移植，具有操作簡單、副損傷小、骨膜瓣來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)[1]，但王劍利等[2]報(bào)道的6例臨床應(yīng)用中，2例出現(xiàn)一端不愈合、1例并發(fā)感染、1例并發(fā)骨折，并認(rèn)為導(dǎo)致該問題的原因?yàn)楣悄ぐ陱?fù)合的位置及異體骨血管化受限。因此，我們將帶薄層皮質(zhì)骨的骨膜瓣嵌入開窗的異體骨，為臨床長段骨缺損的治療提供參考和資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康正常成年家兔60只，體質(zhì)量2.5～3.5 Kg，雌雄不限，由解放軍89醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為3組（n=20），即實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白對(duì)照組。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

計(jì)算機(jī)控制溫度速率儀（美國MVE公司）、深低溫冰箱（美國Dupont Suva公司）、口腔電動(dòng)磨鉆（荷蘭Philips公司）、計(jì)算機(jī)X線成像(CR)（美國GE公司）、2500E型切片機(jī)（德國LEICA公司）、VEGF免疫組化試劑盒（美國RD生物工程公司）、EDTA（臺(tái)州市晶皓化工有限公司）、TBS（臺(tái)州市晶皓化工有限公司）。

1.3 大段同種異體骨的制作

健康正常成體家兔10只，無菌條件下截取雙側(cè)脛骨干3.0 cm，去除軟組織，刮除骨髓，鹽水反復(fù)沖洗干凈，浸泡于慶大霉素鹽水中，用雙層血漿袋保存。計(jì)算機(jī)控制溫度速率儀按2℃/min的降溫速率將骨組織的環(huán)境溫度降至-80℃，再置入深低溫冰箱中保存。共制備異體骨段標(biāo)本20個(gè)備用。

1.4 手術(shù)方法

動(dòng)物禁食水12 h，左后肢脫毛，3%戊巴比妥鈉按30 mg/Kg的劑量靜脈滴入，麻醉生效后，常規(guī)消毒鋪無菌單，于小腿中段作一約3 cm的縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織，分離并保護(hù)脛前血管及其分支，切除1 cm長脛骨，制成脛骨骨缺損模型。將已制備的長管狀同種異體骨按兩步解凍法解凍，截成1 cm長骨段備用。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)組

切取1/2周徑骨膜及其附帶的薄層骨皮質(zhì)，保留骨膜表面的薄層肌袖。以口腔磨鉆于大段異體骨中部開一骨窗，面積約5 mm×5 mm、深約1 mm（圖1、2），大小與骨膜瓣相近，深達(dá)骨松質(zhì)，將異體骨嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針?biāo)鑳?nèi)固定，然后將骨膜瓣嵌入骨窗，絲線捆綁。

1.4.2 對(duì)照組

切取1/2周徑骨膜及其表面的肌袖，異體骨直接嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針?biāo)鑳?nèi)固定，骨膜瓣包裹覆蓋，絲線捆綁。

1.4.3 空白對(duì)照組

將骨膜及表面的肌袖徹底剝離后去除，異體骨直接嵌入骨缺損處，直徑2.0 mm的克氏針?biāo)鑳?nèi)固定。關(guān)閉切口，無菌敷料包扎固定。

自手術(shù)日起,所有動(dòng)物每日2萬單位的慶大霉素肌肉注射，連續(xù)一周。隔天換藥。

1.5 觀察指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后依次于4、8、12、16周處死并觀察以下指標(biāo)。

1.5.1 大體觀察

解剖出異體骨標(biāo)本，肉眼觀察新生骨痂數(shù)量，骨膜瓣及骨組織血運(yùn)及骨膜瓣與異體骨貼附結(jié)合情況。

1.5.2 X線攝片及骨痂半定量分析

術(shù)后立即、術(shù)后的4，8，12，16周分別截取動(dòng)物左后肢行X線的檢測(cè)，每次每組隨機(jī)抽取2只，仔細(xì)觀察不同時(shí)期內(nèi)的骨缺損愈合情況，骨痂的形成情況。并將CR圖像存入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)各組骨痂區(qū)相同面積進(jìn)行分析，計(jì)算出骨痂灰度密度積分。

1.5.3 光鏡下組織學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)觀察

分別取術(shù)后4、8、12、16周的骨組織及附帶的骨膜等周圍軟組織，制備10 μm石蠟切片，蘇木精伊紅(HE)染色觀察。

每組任取10張切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)后，應(yīng)用SABC法對(duì)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性因子VEGF進(jìn)行原位標(biāo)記。光鏡下觀察新生小血管的分布，隨機(jī)選取4個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組移植骨段大體觀察

①實(shí)驗(yàn)組：4周時(shí)已形成纖維包裹，移植骨與宿主骨之間有大量纖維連結(jié)，骨膜瓣與移植骨結(jié)合緊密，以骨刀將其剝離后可見較多橫行血管肉芽組織進(jìn)入移植骨；8周時(shí)，兩結(jié)合處連接緊密，骨膜瓣與移植骨融為一體；12周時(shí)移植骨周圍纖維囊硬化，有大量骨痂形成；16周時(shí)已形成新的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，髓腔融合。②對(duì)照組：4周時(shí)異體骨塊形成纖維包裹，骨膜瓣與移植骨貼附松散，偶見小的液化腔；8周時(shí)骨膜瓣可從移植骨表面剝離，有少量橫行血管肉芽進(jìn)入移植骨，移植骨皮質(zhì)凹凸不平；12周時(shí)移植骨周圍纖維囊硬化，有大量骨痂形成；16周時(shí)形成新的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，髓腔部分融合。③空白對(duì)照組：周時(shí)移植骨無顯著變化，移植骨與宿主骨之間有少量纖維連結(jié)；8周時(shí)形成纖維包裹，移植骨與宿主骨之間形成纖維連結(jié)；12周時(shí)兩結(jié)合處仍以纖維連結(jié)為主；16周時(shí)纖維包裹硬化，有少量骨痂。

2.2 X線攝片及骨痂半定量分析

①實(shí)驗(yàn)組：4周時(shí)骨斷端變得稍模糊，可見少量骨痂包繞異體骨，移植骨的形狀和密度無明顯的改變；8周、12周時(shí)接觸面變得模糊，移植物輪廓亦變得模糊，密度稍變低，骨痂包裹移植物，嵌入組皮質(zhì)骨開窗處有大量骨痂形成；16周時(shí)移植骨兩端已與宿主連接，骨密度接近宿主自身骨，開窗處皮質(zhì)骨連續(xù)性大部恢復(fù)（圖3）。②對(duì)照組：4周時(shí)少量骨痂包繞異體骨，移植骨的形狀和密度無明顯的改變；8周、12周時(shí)骨端接觸面變得模糊，移植物輪廓亦變得模糊，密度稍變低；16周時(shí)異體骨周圍有大量骨痂包繞（圖4）。③空白對(duì)照組：4周時(shí)遠(yuǎn)、近端結(jié)合部骨折線清晰，未見外骨痂生長；8周、12周時(shí)移植異體骨段骨密度仍較高，遠(yuǎn)、近端結(jié)合部骨折線變得稍模糊，僅見少量外層骨痂生長；16周時(shí)移植骨周圍有骨痂形成，但其密度和數(shù)量均低于實(shí)驗(yàn)組，骨端骨折線變得模糊，部分內(nèi)固定克氏針斷裂（圖5）。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算骨痂灰度密度積分，實(shí)驗(yàn)組新生骨痂數(shù)量和質(zhì)量優(yōu)于對(duì)照組及空白對(duì)照組（表1），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)骨痂灰度積分Table 1 The average value of callus grey level in different time points

2.3 組織學(xué)觀察

2.3.1 HE染色

①實(shí)驗(yàn)組：4周時(shí)異體骨哈弗管內(nèi)均為無結(jié)構(gòu)狀，異體骨與宿主骨結(jié)合處可見有少量纖維肉芽組織連接，開窗處可見大量纖維肉芽組織侵入松質(zhì)骨骨小梁；8周時(shí)異體骨內(nèi)哈弗管擴(kuò)大，有大量新生血管自開窗處長入并向兩斷端爬行、伴新骨生成，并有少量新生骨小梁突向髓腔內(nèi)，新生血管數(shù)量及新生骨量較多；12周時(shí)新生骨單位和殘存骨單位并存，新生骨單位哈佛氏管內(nèi)可見血管和活的細(xì)胞成分，周邊骨旋渦排列有規(guī)律，其內(nèi)可見大量成骨及破骨細(xì)胞；16周時(shí)開窗處已形成新的密質(zhì)結(jié)構(gòu)，有大量成熟的骨小梁，髓腔基本融合，異體骨內(nèi)部見多數(shù)成熟骨單位，偶見殘存骨單位，骨單位哈佛氏管內(nèi)可見血管和活的細(xì)胞（圖6）。②對(duì)照組：4周時(shí)異體骨哈弗管內(nèi)均為無結(jié)構(gòu)狀，異體骨與宿主骨結(jié)合處可見有少量纖維肉芽組織連接，異體骨邊緣皮質(zhì)有少量不規(guī)則的吸收陷窩；8周時(shí)表面吸收腔擴(kuò)大，與宿主哈弗管相通，有少量新生血管長入并伴新骨生成；12周時(shí)靠近外表面和髓腔側(cè)切片內(nèi)亦可見新生骨單位，中間部位切片仍見大量壞死殘存的骨單位；16周時(shí)僅在自體骨-異體骨連接處見較多成熟骨小梁，連接處髓腔基本融合，異體骨段外周新形成一薄層骨密質(zhì)，異體骨密質(zhì)表面仍可見大量破骨細(xì)胞吸收陷窩及成骨細(xì)胞，異體骨內(nèi)部可見新生骨單位與殘存骨單位并存（圖7）。③空白對(duì)照組：4周時(shí)異體骨哈弗管內(nèi)均為無結(jié)構(gòu)狀；8周時(shí)異體骨邊緣皮質(zhì)有少量不規(guī)則的吸收陷窩；12周時(shí)哈佛氏管擴(kuò)大，其內(nèi)未見細(xì)胞成分，周邊骨旋渦排列紊亂，中央空虛，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)；16周時(shí)哈佛氏管擴(kuò)大，其內(nèi)見新生血管自自體骨-異體骨連接處向內(nèi)部爬行，新生骨單位量較少（圖8）。

2.3.2 免疫組化染色

VEGF陽性效應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀分布于成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及纖維細(xì)胞的細(xì)胞包漿。我們按照以下標(biāo)準(zhǔn)記錄評(píng)分結(jié)果和陽性細(xì)胞數(shù)：①陰性（-）：細(xì)胞內(nèi)無著色，評(píng)分：0 分；②弱陽性（+）：細(xì)胞染成淡黃色，陽性細(xì)胞<25%，評(píng)分：1分；③陽性（++）：細(xì)胞染成黃色，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，評(píng)分：2分；④強(qiáng)陽性（+++）：細(xì)胞染成棕黃色。陽性細(xì)胞數(shù)>50%，評(píng)分：3分。結(jié)果顯示：①正常情況下（即空白對(duì)照組）在移植早期VEGF的表達(dá)僅出現(xiàn)在外周軟組織內(nèi)，移植中期在移植骨外表面及內(nèi)部均有少量表達(dá)，移植晚期在外周骨痂及皮質(zhì)骨表達(dá)較少、松質(zhì)骨部分表達(dá)較多；②實(shí)驗(yàn)組移植骨在整個(gè)爬行替代過程中VEGF表達(dá)水平均較高；早期即在移植骨表面及內(nèi)部有較高水平的表達(dá)，中期及晚期皮質(zhì)骨內(nèi)持續(xù)高水平表達(dá)；晚期外周骨痂形成后，皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨內(nèi)表達(dá)水平仍較高。③對(duì)照組移植骨VEGF表達(dá)水平較嵌入組為低，皮質(zhì)骨內(nèi)表達(dá)低下，待外周骨痂形成后更進(jìn)一步降低（表2-4）。

表2 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)、不同區(qū)域VEGF的表達(dá)Table 2 The VEGF expression of experimental group in different time points and different regions

表3 包裹組不同時(shí)間點(diǎn)、不同區(qū)域VEGF的表達(dá)Table 3 The VEGF expression of control group in different time points and different regions

表4 空白對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)、不同區(qū)域VEGF的表達(dá)Table 4 The VEGF expression of blank group in different time points and different regions

圖1 異體骨開窗面積Fig.1 Bone window area of allograft bone

圖2 異體骨開窗深度Fig.2 Bone window depth of allograft bone

圖3 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周X線片F(xiàn)ig.3 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in experimental group

圖4 對(duì)照組術(shù)后4周X線片F(xiàn)ig.4 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in control group

圖5 空白對(duì)照組術(shù)后4周X線片F(xiàn)ig.5 The X-ray film of the rabbit tibia 4 weeks after operation in blank group

圖6 實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)觀察見新生骨皮質(zhì)（HE，400×）Fig.6 New bone cortex formation was observed in experimental group by HE staining(HE,400×)

圖7 對(duì)照組組織學(xué)觀察見殘存骨單位（HE，400×）Fig.7 Remaining bone unit was observed in control group by HE staining(HE,400×)

圖8 空白對(duì)照組組織學(xué)觀察見髓腔內(nèi)壞死（HE，400×）Fig.8 Marrow necrosis was observed in blank group by HE staining (HE,400×)

3 討論

帶血管骨膜瓣復(fù)合異體骨移植是近年來顯微外科技術(shù)在異體骨移植領(lǐng)域的新進(jìn)展，諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)【3】證明了帶血管骨膜瓣具有改善受區(qū)骨床血供、促進(jìn)大段異體骨血管化、加速異體骨爬行替代速度的優(yōu)點(diǎn)，但該方法在臨床實(shí)際應(yīng)用中的效果卻欠佳，尤其是與經(jīng)典的帶血管腓骨瓣復(fù)合移植相比。我們認(rèn)為導(dǎo)致該問題的原因包括：①直接以骨膜瓣包裹異體骨段，骨膜瓣容易因?yàn)槭中g(shù)操作中周圍軟組織嵌入、骨缺損斷端截骨產(chǎn)生的血腫、移植早期急性排斥反應(yīng)導(dǎo)致的炎性滲出等原因致使骨膜瓣自異體骨表面浮起、貼附不緊密，必然會(huì)影響骨膜瓣作用的發(fā)揮。②帶血管骨膜瓣不僅可以提供豐富的血供，更重要的是它具有很強(qiáng)的成骨作用。組織學(xué)研究【4】表明骨膜分淺表的纖維層、中間的血管性未分化層和深面的生發(fā)層。纖維層中有Sharpy纖維穿入骨質(zhì)，起固定骨膜和韌帶的作用。生發(fā)層緊貼骨表面，血管和細(xì)胞豐富，有成骨能力，又稱成骨層。由于Sharpy纖維將骨膜與骨緊緊相連，從骨上掀起骨膜時(shí)，骨膜的生發(fā)層會(huì)受到損傷，不可避免地會(huì)響骨膜的成骨能力。因此單純以骨膜覆蓋而不附帶薄層皮質(zhì)骨，有影響骨膜瓣成骨活性的可能。③皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)緊密，其爬行替代過程表現(xiàn)為第一階段暴露緣被破骨細(xì)胞吸收，形成“陷窩”或“網(wǎng)眼”，哈弗管轉(zhuǎn)變?yōu)樾〉乃枨?，肉芽組織長入，原始間充質(zhì)細(xì)胞充填大的腔隙；第二階段髓腔達(dá)到預(yù)想的大小，吸收停止，成骨細(xì)胞充填腔隙同時(shí)伴有活性的骨樣組織沉積。因此，直接與皮質(zhì)骨相接觸的骨膜瓣雖然可以提供充足確實(shí)的局部血供、大量的活性骨細(xì)胞、細(xì)胞因子等有利于異體骨愈合的因素，但如果無法募集及分化出大量破骨細(xì)胞、單核及多核巨噬細(xì)胞[5]，必然會(huì)導(dǎo)致爬行替代的不完全。④實(shí)驗(yàn)中可見，在中晚期隨著對(duì)照組骨膜瓣下新骨的沉積、異體骨表面骨痂的形成，異體骨內(nèi)部的血管化速度、新骨生成量進(jìn)一步下降，即由于新骨的生成，阻礙了骨膜內(nèi)血管向異體骨深部長入、限制了內(nèi)部破骨細(xì)胞的量，導(dǎo)致表層皮質(zhì)骨被替代，而深層皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨的替代受到限制。這是直接包裹法的又一缺點(diǎn)。

針對(duì)上述問題，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中進(jìn)行了相應(yīng)改進(jìn)。①經(jīng)開窗嵌入，骨膜瓣與大段異體骨中部結(jié)合緊密，確實(shí)可靠的結(jié)合是骨膜瓣發(fā)揮作用的前提條件。在實(shí)驗(yàn)中可見，骨膜瓣附帶的薄層皮質(zhì)骨早期即可與異體骨段形成纖維連結(jié)，隨著骨質(zhì)沉積，徹底與異體骨融為一體。帶血管骨膜瓣所提供的豐富的血供及其生發(fā)層募集、分化的各種活性骨細(xì)胞可通過此薄層皮質(zhì)骨進(jìn)入異體骨段深部，事實(shí)上成為了骨缺損兩斷端之外的第三個(gè)爬行替代的“活化中心”，其作用類似于帶血管腓骨瓣復(fù)合異體骨移植中的自體骨，且在爬行替代結(jié)束后成為“異體骨”皮質(zhì)的一部分。②切取骨膜瓣時(shí)，用銳利骨鑿鑿取薄層皮質(zhì)骨并同時(shí)掀起骨膜。一方面，能完整獲得范圍較大的骨膜；另一方面，既不損傷骨膜又保留了皮質(zhì)骨的活力，兩者在受區(qū)共同作用，充分發(fā)揮骨膜瓣的成骨潛能，加速異體骨的爬行替代。③將骨膜瓣由直接包裹改為嵌入，改變了大段異體骨中部爬行替代的次序。深部的松質(zhì)骨首先活化，有新生血管及肉芽組織長入，繼而在松質(zhì)骨及髓腔內(nèi)形成大量骨痂，而皮質(zhì)骨則由外骨痂經(jīng)改造塑形后重新形成。松質(zhì)骨是具有高度疏松多孔的、開放的小梁狀結(jié)構(gòu)，而皮質(zhì)骨中的孔隙主要為致密板層骨的哈佛管及?？寺芟到y(tǒng)，其孔隙率、孔徑及孔隙間的交通率均明顯低于松質(zhì)骨，在移植早期出現(xiàn)的局部創(chuàng)傷、血腫形成及纖維機(jī)化過程中兩者并無差異，而其后的毛細(xì)血管長入則大為不同，松質(zhì)骨移植后后數(shù)小時(shí)內(nèi)血管化已開始，至大約2周時(shí)已達(dá)到完全血管化，而皮質(zhì)骨的完全血管化需大約2個(gè)月時(shí)間，此時(shí)的松質(zhì)骨已完全被新生骨和骨樣組織所填滿[6，7]。因此這一改變從整體上加速了爬行替代的速度，此外還避免了后期表面骨痂的形成對(duì)深部異體骨替代的阻礙。因此在實(shí)驗(yàn)中嵌入法與包裹法相比在血管化速度、新骨生成及完全愈合后生物力學(xué)強(qiáng)度三方面均表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)。

針對(duì)今后的臨床應(yīng)用，我們認(rèn)為本方法在使用中應(yīng)注意：①切取皮質(zhì)骨-骨膜瓣時(shí)應(yīng)仔細(xì)游離并保護(hù)其營養(yǎng)血管，注意兩者的解剖聯(lián)系，勿使骨膜與皮質(zhì)骨分離。②皮質(zhì)骨-骨膜瓣切取的位置以股骨內(nèi)側(cè)髁區(qū)域?yàn)槭走x，即形成以膝降動(dòng)脈為蒂的骨膜瓣[8]。此處位置表淺、血管變異較少、皮質(zhì)骨菲薄、可取面積較大（平均6 cm×3 cm），并且可附帶相應(yīng)皮瓣修復(fù)皮膚缺損[9]。③由于大段異體骨中部皮質(zhì)骨開窗，必然會(huì)導(dǎo)致開窗側(cè)的應(yīng)力集中，有導(dǎo)致異體骨醫(yī)源性骨折的可能性。因此采用髓內(nèi)固定、避免偏心固定，并于移植早期輔助以適當(dāng)外固定是必要的。隨著移植后期大段移植骨改造塑形結(jié)束，“異體骨”強(qiáng)度得以恢復(fù)，該問題自然會(huì)得以解決。

以帶血管薄層皮質(zhì)骨-骨膜瓣嵌入開窗的異體骨修復(fù)大段骨缺損的手術(shù)方法優(yōu)于以骨膜瓣直接包裹異體骨的方法，縮短骨缺損修復(fù)的時(shí)間，提高修復(fù)的程度，在臨床大段骨缺損的治療中有廣闊的應(yīng)用前景。

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