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    酶洗法制備兔組織工程氣管支架的周期研究

    2012-12-09 13:47:26李建忠張志培汪健吳凡金巖韓勇姜濤閆小龍倪云峰趙晉波李小飛
    組織工程與重建外科雜志 2012年1期
    關(guān)鍵詞:洗法異體掃描電鏡

    李建忠 張志培 汪健 吳凡 金巖 韓勇 姜濤 閆小龍 倪云峰 趙晉波 李小飛

    組織工程同種異體氣管移植是當(dāng)前氣管外科領(lǐng)域研究的重點。已有報道用酶洗法制備豬氣管支架,但實驗尚存在諸多不確定因素[1],國內(nèi)外尚未有用酶洗法制備兔氣管支架研究的相關(guān)報道。本實驗探討酶洗法制備兔氣管支架的適宜周期,為研究組織工程同種異體氣管移植提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    脫氧膽酸鈉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),脫氧核糖核酸酶-Ⅰ(DNase-Ⅰ)(Roche公司,德國),兩性霉素 B(Amresco公司,美國),青霉素(哈藥集團制藥總廠),蔡司正置顯微鏡Axioskop 40(ZEISS公司,德國),鎢燈絲掃描電鏡VEGA3 LMH(Tescan公司,捷克),電子實驗機(Shimadzu公司,日本)。

    1.2 實驗動物與分組

    健康新西蘭兔24只,體質(zhì)量2.5~3.0 Kg,雌雄不限,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。隨機等分為4 組(n=6)。A 組,對照組,新鮮氣管;B、C、D 組,實驗組,氣管分別經(jīng)過2、3、4個周期的處理。

    1.3 氣管支架制備方法

    耳緣靜脈空氣栓塞致死,無菌條件下取出氣管,迅速剝離氣管上的疏松結(jié)締組織。經(jīng)含有1%青霉素、1%兩性霉素B的PBS緩沖液沖洗3~4min后,A組氣管浸泡在4℃的PBS緩沖液中準(zhǔn)備檢測;B、C、D組氣管沖洗后均置入4℃純凈水中浸泡48 h。取出后在含有4%脫氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3 h,PBS沖洗3~4min。然后在含有2000 KU/LDNase-Ⅰ的生理鹽水中浸泡3 h,B、C、D組分別如此循環(huán)2、3、4個周期,處理好的標(biāo)本浸泡在4℃的PBS溶液中準(zhǔn)備檢測。

    1.4 檢測方法

    將處理后的氣管參照 Macchiarini[2]生物力學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)進行完整氣管力學(xué)檢測;取長約0.5 cm氣管環(huán)于中性福爾馬林固定24h,行脫水、浸蠟、包埋、切片處理后,HE染色后組織學(xué)觀察;取長約1.5 cm氣管環(huán)以戊二醛固定后,掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 生物力學(xué)檢測

    生物力學(xué)檢測顯示:各組氣管長度均數(shù)不相等,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組間兩兩比較顯示,D組最大拉伸力、破裂力、變異率均小于A組、B組、C組,差異顯著(P<0.05);而 A 組、B 組、C 組兩兩比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(表1)

    表1 氣管支架生物力學(xué)比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups()

    表1 氣管支架生物力學(xué)比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups()

    變異率(%)對照組 A 5.02±0.604.465±0.65 0.645±0.072 9.64±0.48 202±8實驗組 B 4.98±0.574.425±0.55 0.535±0.082 9.48±0.50 198±10實驗組 C 4.96±0.584.375±0.45 0.525±0.064 9.58±0.52 197±9實驗組 D 5.10±0.612.855±0.30*0.350±0.042*9.86±0.46142±18*組 別 氣管長度(cm)最大拉伸力(N) 破裂力(N) 破裂點(cm)

    2.2 組織學(xué)觀察

    HE染色顯示:A組氣管黏膜上皮組織可見大量完整的黏膜上皮細胞;B組氣管黏膜上皮組織見部分完整黏膜上皮細胞;C組、D組氣管黏膜上皮細胞未見完整的黏膜上皮細胞(圖1)。

    圖1 組織學(xué)觀察(HE,400×)Fig.1 Histological observation of tracheas(HE,400×)

    2.3 掃描電鏡觀察

    掃描電鏡顯示A、B、C組的氣管支架膠原纖維間有殘存的細胞基質(zhì),膠原纖維較粗;D組的氣管支架未見細胞基質(zhì),膠原纖維較細(圖2)。

    圖2 掃描電鏡觀察:(SEM,3000×)Fig.2 Ultrastructure observation by SEM(SEM,3000×)

    3 討論

    全球首例組織工程同種異體左主支氣管成功移植[3]后,組織工程同種異體氣管移植已成為氣管重建領(lǐng)域的研究熱點,但尚未有組織工程同種異體氣管移植的相關(guān)報道。氣管支架的構(gòu)建和再細胞化是構(gòu)建組織工程同種異體氣管的主要制約因素。氣管支架既需有理想的去抗原效果、生物力學(xué)性能,又需最大限度地保持細胞外基質(zhì)的完整性,以達到支架支撐效果,并有助于同種異體成軟管細胞和氣管黏膜上皮細胞的再細胞化。

    在深低溫冷凍法[4-5]、玻璃化液冷凍法[6-7]及酶洗法[1-3]三種主要制備氣管支架的方法中,酶洗法越來越受到關(guān)注。本研究采用酶洗法分別處理3個實驗組2、3、4個周期,制備氣管支架,并與未處理氣管進行比較。生物力學(xué)結(jié)果比較顯示,處理3個周期的氣管支架的最大拉伸力、破裂力和變異率顯著大于處理4個周期的氣管支架。實驗證明處理周期太短則有完整的黏膜上皮細胞殘存,不能有效去除氣管的抗原性,處理周期太長則損壞細胞外基質(zhì),影響氣管支架的再細胞化。綜上所述,采用4%脫氧膽酸鈉及2000 KU/L DNase-Ⅰ處理兔氣管3個周期,既具有理想的去抗原效果、生物學(xué)性能,又最大限度地保持了細胞外基質(zhì)的完整性,適于構(gòu)建兔組織工程同種異體氣管。

    [1]Go T,Jungebluth P,Baiguero S,et a1.Both epithelial cells and mesenchymal stem cell derivedchondrocytes contribute to the survival of tissue-engineered airwaytransplants in pigs[J].Thorac Cardiovasc Surg,2010,139(2):437-443.

    [2]Macchiarini P,Baiguera S,Jungebluth P,et a1.Tissue engineered human tracheas for in vivo implantation[J].Biomaterials,2010,31(34):8931-8938.

    [3]Macchiarini P,Jungebluth P,Go T,et al.Clinicaltransplantation of a tissue-engineered airway[J].Lancet,2008,372(9655):2023-2030.

    [4]閆小龍,李小飛,劉勇.深低溫冷凍對rhBMP-2誘導(dǎo)犬氣管移植體軟骨再生的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,26(2):160-163.

    [5]Autissier A,Le Visage CL,Pouzet C,et a1.Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process[J].Acta Biomater,2010,6(9):3640-3648.

    [6]史宏燦,徐洪,吳俊,等.玻璃化冷凍同種異體氣管移植動物模型的建立[J].中華外科雜志,2008,46(20):1589-1590.

    [7]Xu H,Shi HC,Zhang WF,et a1.An experimental research on cryopreserving rabbit trachea by vitrification[J].Cryobiology,2009,58(2):225-231.

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