外周血干細胞移植對動物肢體局部化膿性感染的影響＊

耿躍春 任思坡 拾 莉 譚 坤 韓光宇

江蘇省徐州市醫(yī)學科學研究所 221006

由于干細胞具有自我更新和分化的潛能，人們正在研究通過干細胞移植來替代和修復機體損傷的細胞、恢復細胞組織功能來治療疾病的可能性。筆者在研究用干細胞移植技術(shù)改善糖尿病動物下肢缺血的同時，發(fā)現(xiàn)將外周血干細胞移植到動物下肢缺血的局部后，外周血干細胞具有對抗手術(shù)切口化膿性感染的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 新西蘭白兔39只，體重3.1～3.6kg，平均3.34kg，雌雄不限，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。將動物分成（1）移植對照組（A1組）：12只，僅以粒細胞集落刺激因子動員外周血干細胞，不對動脈缺血模型動物下肢進行干細胞移植；（2）干細胞治療組（A2組）：12只，外周血動員后干細胞移植到動脈缺血模型動物的下肢；（3）糖尿病干細胞移植組（B1組）：8只，外周血干細胞動員后干細胞移植到糖尿病動物缺血下肢；（4）糖尿病干細胞移植后注射青霉素組（B2組），7只。

1.2 主要材料 粒細胞集落刺激因子（G－CSF廈門特寶公司生產(chǎn)），兔淋巴細胞分離液（密度1.096 5 g／ml，天津灝陽公司生產(chǎn)）。血糖儀（美國強生公司生產(chǎn)），四氧嘧啶（Sigma公司生產(chǎn)）。

1.3 干細胞動員 術(shù)前連續(xù)4d以7.5μg／kg每天經(jīng)皮下注射粒細胞集落刺激因子進行干細胞動員。給藥前及給藥過程中分別經(jīng)耳緣靜脈采血進行白細胞計數(shù)。

1.4 下肢動脈缺血模型制作方法 術(shù)前12h禁食禁水，手術(shù)時以10g／dl水合氯醛1.8ml／kg耳緣靜脈緩慢推入，待角膜反射遲鈍后仰臥固定，無菌手術(shù)室內(nèi)右下肢常規(guī)備皮消毒，鋪無菌洞巾，沿股動脈走向切開皮膚，暴露股三角區(qū)，從腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)，鈍性分離血管鞘，將所有動脈分支包括股深動脈、旋股外側(cè)動脈、陰部動脈、腘動脈及股淺動脈等結(jié)扎并離斷剔除股動脈，分層縫合肌肉及皮膚。

1.5 干細胞移植［1］肝素潤濕20ml注射器及頭皮針，手術(shù)麻醉前經(jīng)耳靜脈采集20ml外周血，肝素抗凝。生理鹽水1∶1稀釋，置于兔淋巴細胞分離液上，2 000r／min離心20min，分離單個核細胞，生理鹽水洗滌3次。調(diào)整細胞密度1×107／ml，肌肉層縫合后沿手術(shù)切口走向兩側(cè)用1ml皮試針分10～12點注射。對照組（A1組）注射等量生理鹽水。

1.6 糖尿病模型制作方法［2］按50mg／kg體重經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射新鮮配制的5%四氧嘧啶（alloxan，ALX）；2周后第2次給藥，按100mg／kg體重再次注射新鮮配制的5%ALX。給藥后均密切觀察，14d后測空腹血糖值，以空腹血糖＞16mmol／L作為造模成功用于動物實驗。

1.7 觀測指標 （1）動態(tài)觀察 ：觀察動物活動情況，肢體顏色、溫度變化（紅外體溫檢測儀DT－880B型，深圳華盛昌公司），肌肉萎縮情況。（2）10 M Hz多普勒超聲儀：術(shù)后1d于缺血股內(nèi)側(cè)正中部位行彩色多普勒血流灌注顯像和頻譜多普勒檢測。（3）毛細血管密度測定：移植4周后，經(jīng)耳緣靜脈注射20ml空氣處死家兔，取股骨中段和脛骨背側(cè)的肌肉3～5塊，10%甲醛溶液固定24h，石蠟包埋，做成10μm厚的切片，v WF免疫組化染色，在光學顯微鏡下，每張切片隨機計數(shù)5個高倍視野內(nèi)的棕黃色染色管狀數(shù)取其平均數(shù)，計數(shù)新生毛細血管數(shù)。（4）手術(shù)切口觀察：觀察動物下肢動脈缺血造模后手術(shù)切口滲出及化膿情況，以及手術(shù)切口愈合情況。根據(jù)衛(wèi)生部《疾病和有關(guān)健康問題的國際統(tǒng)計分類》、中國病案管理、解放軍總后勤部衛(wèi)生部《醫(yī)療護理技術(shù)操作常規(guī)》［3，4］，按切口分類方法記錄切口化膿動物例數(shù)。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS15.0軟件，使用χ2檢驗的精確概率檢驗法（Fisher’s exact test）進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 所有肢體缺血造模動物手術(shù)后拒動，進食、進水少，缺血肢體蜷縮，活動出現(xiàn)跛行。皮膚蒼白，造模肢體皮膚溫度22.5～27.1℃，平均24.9℃，較健側(cè)平均溫度低6.6℃（30.1～31.8℃），肢體末端發(fā)紺明顯。1周后，干細胞移植的缺血肢體溫度略有回升，平均達28.6℃，仍較健側(cè)溫度低。2.2 彩色多普勒血流灌注顯像及血流頻譜圖 手術(shù)前顯示股內(nèi)側(cè)正中部位動脈血流呈收縮期單峰頻譜，上升與下降均較快。阻力指數(shù)高，為高速高阻型動脈波；手術(shù)后檢測動脈離斷部位無血流信號，表明手術(shù)肢體的血液供應(yīng)完全被阻斷，動脈缺血模型制備成功。

2.3 毛細血管密度測定 高倍鏡下干細胞移植組毛細血管密度平均為19.7個，對照組為12.4個。移植后的肌肉標本毛細血管密度明顯高于對照組，差異有顯著性統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明干細胞移植有效果。

2.4 外周血干細胞移植后化膿感染觀察 外周血干細胞動員后，進行了干細胞移植的動物，肢體切口多數(shù)愈合良好，化膿性感染率低。未進行干細胞移植的對照組，多數(shù)發(fā)生了化膿性感染。干細胞移植組感染率為16.67%，對照組感染率為66.67%，兩組差異具有統(tǒng)計學顯著意義（P＜0.05）。

2.5 糖尿病兔外周血干細胞移植后化膿感染觀察糖尿病模型動物缺血肢體進行的外周血干細胞移植后仍有多數(shù)發(fā)生了切口感染，化膿率75%；而使用青霉素后大部分感染得到控制，感染率降為14.29%（P＜0.05）。

3 討論

造血干細胞移植（HSCT）是治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤等比較有效的方法。隨著造血干細胞移植技術(shù)的改善、新型廣譜強效抗生素的產(chǎn)生，以及隔離、消毒和預防技術(shù)的成熟，造血干細胞移植的感染及死亡率已明顯降低，但是感染仍然是造血干細胞移植患者的主要并發(fā)癥。由于患者自身的狀態(tài)不同，易感因素多，造成感染率高，感染復雜多變，控制難度大，抗生素應(yīng)用時間長。感染的易感因素主要包括移植前多個療程化療所造成的免疫功能損害、移植時大劑量放化療引起免疫系統(tǒng)的破壞和黏膜損傷、免疫抑制劑的應(yīng)用、高效廣譜抗生素的大范圍應(yīng)用、患者攜帶細菌及病毒難以完全清除以及耐藥菌株的大量出現(xiàn)等［5］。感染病變可能發(fā)生在身體的任何部位，病原體種類主要包括細菌、真菌和病毒等。早期尤以細菌感染多見，也是患者主要致死原因之一。

本實驗在用干細胞對動物缺血組織進行局部移植的結(jié)果顯示，外周血干細胞移植可明顯降低正常動物的局部組織化膿性感染率。說明在沒有感染的易感因素存在的情況下，正常動物在沒有受到外來免疫抑制或損害時，干細胞的移植本身在局部是可以有抗感染作用的。這與臨床上造血干細胞移植術(shù)因清髓、免疫抑制劑的使用等，造成全身免疫系統(tǒng)機能降低而容易發(fā)生感染的情況是不同的。而在糖尿病模型進行的實驗，動物即使移植了外周血干細胞，其肢體局部仍然會有很高的感染率，這與臨床上糖尿病患者傷口容易感染是一致的。糖尿病模型動物出現(xiàn)的感染可能與動物免疫力低下有關(guān)，這一點也提示在進行糖尿病模型動物手術(shù)實驗時，為防止感染現(xiàn)象的發(fā)生，需要使用抗菌素給予預防是必要的。

［1］ 韓光宇，任思坡，譚昆，等 .自體外周血干細胞移植治療家兔肢體缺血〔J〕.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2011，26（2）：109－111.

［2］ 雷春靈，孫文濤，畢春潮，等 .四氧嘧啶給藥次數(shù)對制作兔糖尿病模型的影響〔J〕.第四軍醫(yī)大學學報，2009，30（10）：3－10.

［3］ 劉曾鼎，劉愛民，速昌華，等 .疾病和有關(guān)監(jiān)控問題的國際分類〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.

［4］ 余永明.中國病案管理〔M〕.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2000：226－232.

［5］ 李君蕊，趙寶春，辛桂榮.造血干細胞移植與臨床感染的防治〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（42）：8553－8556.