缺血性心臟病的再生治療——聚焦心臟干細(xì)胞

馬根山

心肌梗死導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失、疤痕形成、心室重塑并最終導(dǎo)致心力衰竭。藥物治療、介入治療和外科手術(shù)的進步使冠心病心肌梗死患者的急性期死亡率明顯降低，但卻不能使心肌細(xì)胞重生，不能解決導(dǎo)致心室重塑、心功能下降的根本問題，因此在心肌梗死死亡率下降的同時伴隨著心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率的升高。細(xì)胞治療的目的是心肌再生和新生血管形成，進而改善臨床治療效果。細(xì)胞療法有可能防止甚或逆轉(zhuǎn)心力衰竭的病理生理進展，是一個有潛力的新的治療方法。雖然胚胎干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞和構(gòu)建新血管所需的所有細(xì)胞類型。然而，除了倫理學(xué)原因(因為有成瘤的可能)至今還沒有任何一個臨床研究用胚胎干細(xì)胞來進行心臟再生。

1 心肌細(xì)胞的更新

傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為心臟是一個終末分化器官，心肌細(xì)胞的數(shù)量在出生時就已固定了。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)在胎兒、新生兒、成人及肥大心臟中心肌細(xì)胞具有有絲分裂現(xiàn)象，暗示心肌中存在一個原始的、未分化的細(xì)胞群。這一發(fā)現(xiàn)揭示了一個截然不同的新的心臟生物學(xué)觀念，認(rèn)為在出生后的生命過程中包括成年期和老年期一直存在心肌細(xì)胞生成，心臟在整個生物體生命過程中具有顯著的生長儲備。

2009年Bergmann等［1］發(fā)現(xiàn)由于冷戰(zhàn)時期過度的核試驗，14C的濃度在不同年齡層次的人群中有顯著的差異，通過檢測人體心肌細(xì)胞核內(nèi)14C濃度的變化，發(fā)現(xiàn)成人的心肌細(xì)胞一直在更新，在25歲左右時心肌細(xì)胞的年更新率為1%，到75歲時年更新率為0.45%，在人的一生中，有約50%的心肌細(xì)胞更新過了。2010年，Kajstura等［2］研究心肌細(xì)胞及心臟干細(xì)胞的增殖、老化、凋亡及端粒長度，發(fā)現(xiàn)女性心肌細(xì)胞的年更新率在20歲時為10%，60歲時為14%，100歲時為40%，與之相對應(yīng)的，男性心肌細(xì)胞的年更新率分別為7%、12%、32%。這個研究說明隨著生命個體的老化，心肌內(nèi)實質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量逐漸顯著增加。從20歲到100歲，女性心肌細(xì)胞更新了15次，而男性11次。這些研究均證實人類心臟是一個動態(tài)器官，其本身的心臟干細(xì)胞群調(diào)節(jié)著心臟的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并控制著器官的老化。

2 心臟固有干細(xì)胞

自2002年Hierlihy等［3］首次報道在成體心肌中鑒別出了一個固有祖細(xì)胞池后，一些實驗室也相繼從成體心臟中分離并鑒定出心臟干/祖細(xì)胞，并證明這些細(xì)胞具有能分化為心臟中所有的主要細(xì)胞類型的能力，包括內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞［4－7］。心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)位于心臟內(nèi)，可以天然的程序性的重組心臟組織，這些細(xì)胞影響著出生后心臟的改編。在沒有損傷的情況下，CSCs也為生理性的心臟細(xì)胞更新提供新的心肌細(xì)胞。因此，心臟干細(xì)胞具有再生梗死心臟的潛能，它們本質(zhì)性的適合于生成心臟組織并增強心臟組織活力，在探索心臟再生治療方面CSCs優(yōu)于其他干/祖細(xì)胞，是一個合理的種子細(xì)胞。

CSCs是未分化細(xì)胞，它們中的一些表達(dá)早期心肌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.5，GATA-4，MEF2)。CSCs可通過幾個表面標(biāo)記如c-kit、Scal-1、MDR1、Isl-1等檢出，但這些表面標(biāo)記并非CSCs特有。CSCs與其他干細(xì)胞不同，它們是典型的Lin－，CD34－和CD45－。目前，研究者們以不同的干/祖細(xì)胞抗原為基礎(chǔ)已從成體心臟組織中分離、擴增出未分化細(xì)胞，包括c-kit+細(xì)胞、sca-1+細(xì)胞、側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞、心球樣細(xì)胞和Islet+心臟祖細(xì)胞。

3 c-kit+心臟干細(xì)胞

c-kit+細(xì)胞已被證實是心臟的組成成分，它們的激活導(dǎo)致了新的心肌的生成［8－9］。c-kit+的心臟干細(xì)胞是到目前為止研究得最徹底的心臟干/祖細(xì)胞群。c-kit，干細(xì)胞因子，是一個許多成體干細(xì)胞都有的共同干細(xì)胞標(biāo)記。2003年，Beltrami［4］等首次從成體心臟中分離出c-kit+心臟干細(xì)胞并系統(tǒng)地描述了它們的特性。c-kit+心臟干細(xì)胞表達(dá)許多譜系標(biāo)記，如GATA-4，GATA-5，Nkx2.5和MEF2，而不表達(dá)骨骼肌系、血細(xì)胞系和神經(jīng)系的表面標(biāo)記，它們位于心肌細(xì)胞的間質(zhì)部位，以心房和心尖部密度較高。

2007年Bearzi等［10］報道人類手術(shù)標(biāo)本中鑒定出c-kit+心臟干細(xì)胞，類似于動物模型中所顯示的，人c-kit+心臟干細(xì)胞在體外顯示出自我更新、形成克隆和多向分化潛能，并且可以移植進正常和受損心臟。新生的心肌細(xì)胞、毛細(xì)血管和動脈被鑒定出是人類起源的［10］。

4 Sca-1+心臟干細(xì)胞

Sca-1，干細(xì)胞抗原1，是造血系干細(xì)胞的共同標(biāo)記，不過它也表達(dá)在許多干細(xì)胞、祖細(xì)胞和不同組織中分化了的細(xì)胞上［11］。在c-kit+心臟干細(xì)胞報道的同時，Oh等［6］報道在成體小鼠的心臟內(nèi)鑒定出Sca-1的心臟祖細(xì)胞，并且證明在體內(nèi)和體外這些細(xì)胞能分化為心肌系細(xì)胞。Matsuurra等［12］研究發(fā)現(xiàn)鼠類心臟Sca-1+細(xì)胞在催產(chǎn)素的刺激下能分化為自發(fā)性收縮的心肌細(xì)胞。催產(chǎn)素刺激2周后，大多數(shù)Sca-1+細(xì)胞迅速復(fù)制為高核/漿比例的小圓形細(xì)胞。這些結(jié)果表明成體鼠心臟內(nèi)的Sca-1+細(xì)胞具有干細(xì)胞潛能，并可促進受損心臟的再生。在Sca-1+細(xì)胞和心臟SP細(xì)胞之間有較大的重疊，超過70%的心臟SP細(xì)胞同時也表達(dá)Sca-1。Pfister等［13］研究顯示具有分化為心肌細(xì)胞能力的Sca-1+細(xì)胞多為也表達(dá)SP細(xì)胞表型的細(xì)胞。

5 心球衍生的心臟干細(xì)胞

Messina等［5］是最先描述小鼠及人類心臟活檢標(biāo)本中另一心臟祖細(xì)胞群體的人。這些細(xì)胞在特殊培養(yǎng)條件下能形成細(xì)胞球，稱之為心球。免疫表型分析顯示心球是由不同種類的細(xì)胞群組成的，表達(dá)許多內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記(如KDR、flk-1和CD31)和干細(xì)胞標(biāo)記(如c-kit、Sca-1和CD34)［5］。與其他的心臟干/祖細(xì)胞群相似，這些心球細(xì)胞也顯示了所有心臟干細(xì)胞本質(zhì)特性，因為它們能自我更新，能分化為心臟系和內(nèi)皮系細(xì)胞。而且，植入心球細(xì)胞能改善心肌梗死后小鼠的心臟功能并生成心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。

6 SP細(xì)胞

另一種心臟干細(xì)胞群稱為SP細(xì)胞。SP細(xì)胞在幾種成人組織中發(fā)現(xiàn)，它們能分化為其起源組織的器官特異性細(xì)胞［14］。心臟SP細(xì)胞不同程度的表達(dá)幾種干細(xì)胞因子(Sca-1+，c-kit+)，它們是CD31－，CD34+，CD45－。當(dāng)與心臟細(xì)胞在心肌細(xì)胞特異性培養(yǎng)液中共培養(yǎng)后，心臟SP細(xì)胞能表達(dá)α-肌動蛋白，表示其已分化為心肌細(xì)胞［12］。它們也表達(dá)幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器如Notch和TGF-β，暗示其象胚胎干細(xì)胞一樣具有自我更新的能力。這些SP細(xì)胞作為一個祖細(xì)胞群具有發(fā)生、維護、修復(fù)心臟的作用。

7 心球樣細(xì)胞

2004年，另一個具有心臟干細(xì)胞特性的細(xì)胞群從心臟組織中分離出來，這些自我黏附的未分化細(xì)胞球稱為心球樣細(xì)胞，從出生后的人類或鼠類的心房或心室活檢標(biāo)本培養(yǎng)得到，呈自我黏附的球樣生長。免疫表型分析顯示心球是由不同種類的細(xì)胞群組成的，表達(dá)許多內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記(如KDR、flk-1和CD31)和干細(xì)胞標(biāo)記(如c-kit、Sca-1和CD34)［5］。與其他的心臟干/祖細(xì)胞群相似，這些心球細(xì)胞也顯示了所有心臟干細(xì)胞本質(zhì)特性，能自我更新，能分化為心臟系和內(nèi)皮系細(xì)胞。而且，植入心球細(xì)胞能改善心肌梗死后小鼠的心臟功能并生成心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。

8 Isl-1+細(xì)胞

在新生的嚙齒類和人類心臟中，發(fā)現(xiàn)心臟干細(xì)胞并不表達(dá)c-kit和Sca-1，而是通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子islet-1來辨別它們［15］。它們也表達(dá)那些在心臟發(fā)生早期出現(xiàn)的因子如Nkx2.5、GATA4。當(dāng)與新生的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)時，這些細(xì)胞將分化并接受心肌細(xì)胞表型，包括電活性和收縮性。Isl-1+細(xì)胞的臨床應(yīng)用似乎是有限的，因為它們稀少，到目前為止只有在新生兒的組織中才能被檢測到。

9 心臟干細(xì)胞進行心臟修復(fù)的實驗證據(jù)

第1個心臟修復(fù)的實驗證據(jù)來自Quaini等［9］的觀察報道。在性別差異配對的心臟移植術(shù)后對器官移植受體的分析中發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)存在一個循環(huán)干細(xì)胞池，這些干細(xì)胞能分化為心肌細(xì)胞、冠狀動脈、毛細(xì)血管。在一個移植了女性捐贈者心臟的男性患者身上發(fā)現(xiàn)，受體的原始細(xì)胞已異位到移植的心臟上。Y染色體被用來檢測表達(dá)干細(xì)胞抗原(Sca-1、c-kit、MDR1)的移行的未分化細(xì)胞，并用來區(qū)別受體的原始細(xì)胞和來自供體的原始細(xì)胞。在供體的心臟中有7%～10%的心肌細(xì)胞Y染色體是陽性的，而且這些細(xì)胞處于高增殖狀態(tài)。

2002年，Anversa和Nadal-Ginard［16］報道將雌性小鼠的心臟移植進雄性小鼠的體內(nèi)后，移植后的心臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)含有Y染色體［16］。Hsieh等［17］發(fā)現(xiàn)心肌梗死3個月后，梗死邊緣區(qū)有15%的心肌細(xì)胞是來自內(nèi)源性的心肌干/祖細(xì)胞池。這些現(xiàn)象清楚地表明成年哺乳動物心臟有再生能力?？烧T導(dǎo)Cre-Lox細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)提供了一個可信服的證據(jù)，證明新形成的心肌細(xì)胞不是來自于原先就存在的成熟心肌細(xì)胞，而是來自于心肌干/祖細(xì)胞。

Beltrami等［4］通過BrdU標(biāo)記觀察到心臟干細(xì)胞再生了心肌，特征性表現(xiàn)為由年輕細(xì)胞組成的血管及心肌，最大可包繞心室的70%。心臟超聲檢查顯示左心室射血分?jǐn)?shù)在20 d時與安慰劑組比較有顯著改善［(34±3)%vs(45±10)%］。Dawn等［18］通過冠狀動脈介入輸注1×106c-kit+細(xì)胞。5周時，與對照組比較左心室功能明顯改善［(38.9±2)%vs(48.4±2)%］，并減少約29%心肌梗死的面積。Bearzi等［10］用免疫缺陷小鼠(n=25)和免疫抑制的大鼠(n=19)做實驗，心肌梗死后，輸入的人CSCs能形成一個嵌合體的心臟，它包含由心肌細(xì)胞、冠狀動脈和毛細(xì)血管組成的心肌層。超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測證實這些新生心肌在結(jié)構(gòu)和功能上都與原嚙齒類動物的心臟融為一體，共同維持心臟功能。Wang等［19］研究發(fā)現(xiàn)CSCs移植后3周，小鼠梗死心臟左心室射血分?jǐn)?shù)上升，舒張末期和收縮末期容積下降，心肌新生血管生成明顯增多，伴隨著一定的心肌細(xì)胞再生。證明CSCs能使心功能下降減弱，不利的心臟結(jié)構(gòu)重塑減輕。這些研究顯示了CSCs臨床應(yīng)用的可能。

近來，研究者們已確定了從不同種屬心肌樣本中分離、擴增c-kit+的CSCs的條件。人CSCs主要分化為心肌細(xì)胞，少部分分化為平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［10］。CSCs具有治療心力衰竭的潛能，在臨床各類缺血性或非缺血性心力衰竭患者中，可以在體外分離、擴增CSCs，自體移植到患者體內(nèi)，再生新的心肌組織取代以前無活力的心?。?0－23］?？墒欠蛛x出c-kit+心臟祖細(xì)胞的能力各家報道并不一致，最近的一個報道表示從不同的心臟活體檢查組織中分離出(1～3個細(xì)胞/mm2)足夠數(shù)量的c-kit+細(xì)胞很困難［24］，而Kubo等［25］報道他們從37個人類心臟中的36個分離出了足夠數(shù)量的c-kit+心臟干細(xì)胞，并在體外證明它們具有分化為心肌細(xì)胞的能力。更重要的是，c-kit+心臟干細(xì)胞群已經(jīng)通過了新藥研究審核，目前正處于使用自體心臟干細(xì)胞進行人干細(xì)胞臨床實驗前期準(zhǔn)備的最后階段。

10 結(jié) 語

未來細(xì)胞療法的研究重點主要是以下幾個問題:第一:其臨床治療效果的確切機制，是再生形成新的心肌和血管，還是由于旁分泌效應(yīng)?第二，什么是細(xì)胞輸入的最佳方法?第三，如何讓移植細(xì)胞在我們感興趣的區(qū)域達(dá)到最佳的分化和存活?心臟干細(xì)胞可以天然的程序性的重建心臟組織，且更易于與原有心肌融為一體。心臟干細(xì)胞的研究將會改變心臟疾病的基本治療途徑，這將會改善數(shù)百萬缺血性心臟病患者未來的生活質(zhì)量。

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