“腸病及肺”動(dòng)物模型的建立研究思路探討＊

陳小兵，楊 宇，唐宇嬌，惠 毅，楊瞿嘉，周新穎

（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610075）

中醫(yī)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，人體為一整體，機(jī)體之間的的皮膚，經(jīng)絡(luò)，臟腑，骨髓，存在著連接內(nèi)外，表里溝通的關(guān)系，診療疾病中的“有諸內(nèi)必形于外”即是這一思想的重要應(yīng)用。《靈樞·本輸》言：“肺合大腸”，也就是后世的“肺與大腸相表里”。意指肺與大腸相互關(guān)聯(lián)，相互影響。從而維持人體的正常生命和功能活動(dòng)有著重要的意義。肺合大腸兩者之間主要通過(guò)幾個(gè)方面聯(lián)系：（1）功能上相應(yīng)，《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義》云：“肺為清金。大腸為燥金。肺藏魄。而大腸肛門。即為魄門……此大腸。所以為傳導(dǎo)肺氣之府也”。肺主宣發(fā)，通調(diào)水道，肺對(duì)體內(nèi)的水液，氣機(jī)有宣散，控制等作用。《素問(wèn)·靈蘭秘典論》云：“大腸者，傳導(dǎo)之官，變化出焉”，說(shuō)明大腸對(duì)體內(nèi)的糟粕起輸出作用，在糟粕中，也存在者水液，在輸出的過(guò)程中，也有氣機(jī)起著相應(yīng)的作用，所以兩臟在功能上有一個(gè)共同的作用點(diǎn)，水液和氣機(jī)。（2）生理上相互聯(lián)系，主要表現(xiàn)在，《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞·經(jīng)脈》云：“肺手太陰之脈，起于中焦，下絡(luò)大腸”，“大腸手陽(yáng)明之脈，……絡(luò)肺，下膈?！狈谓?jīng)和大腸經(jīng)除經(jīng)脈的直接連接外，還通過(guò)分出的絡(luò)脈和別出的經(jīng)別相互連絡(luò)。（3）病理上相互傳變，既然兩者有著密切的聯(lián)系，那么在疾病中同樣可以通過(guò)這種聯(lián)系而互相影響，包括兩個(gè)方面，治療中也常常采用相互治療的法則①肺病及腸，腸病治肺。如《理論駢文》云：“風(fēng)寒入肺皆令人咳，肺絡(luò)大腸又與大腸相表里，肺咳不已，往往大腸受之”。說(shuō)明肺氣的閉郁，水液輸布的減弱，影響大腸的傳導(dǎo)失司。②腸病及肺，肺病治腸?！秱摗返?35條：“陽(yáng)明病，脈浮，無(wú)汗而喘者，發(fā)汗則愈，宜麻黃湯”?！堆C論·臟腑病機(jī)論》云：“大腸司燥金，喜潤(rùn)而惡燥，與肺相表里，故病多治肺之法治之?！?/p>

本文擬從“腸病及肺”入手，試圖建立“腸病及肺”的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以期能較全面的模擬人體肺腸之間的聯(lián)系。從而為這一論述，提供依據(jù)，并能解決一些問(wèn)題。

1 既往模型建立概述

中醫(yī)和西醫(yī)在理論和實(shí)踐上有很大的差異，研究和探索過(guò)程中制備的動(dòng)物模型和西方醫(yī)學(xué)的研究也有不同。在中醫(yī)研究的動(dòng)物模型中，不但要考慮病，還要考慮證，因此，評(píng)價(jià)動(dòng)物模型要以病和證相結(jié)合，即最好與中醫(yī)的機(jī)理相符。本實(shí)驗(yàn)?zāi)c病的動(dòng)物模型中，第一，關(guān)鍵要考慮對(duì)肺的影響［1～3］，即腸病及肺，包括各個(gè)方面，如一般情況，如體重，精神，活動(dòng)情況，病理表現(xiàn)能提供直接的證據(jù)，如腸病同時(shí)觀察結(jié)腸與肺的病理切片，同時(shí)觀察炎癥，免疫因子能全面了解腸病炎癥對(duì)肺的影響，肺腸微生物的觀察可以試圖觀察腸病與肺的內(nèi)環(huán)境等。第二，腸病及肺的模型符合中醫(yī)肺腸相關(guān)的紐帶，即肺主宣發(fā)，主運(yùn)化水液，大腸主傳導(dǎo)。

既往建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中概況起來(lái)主要有兩大類，一類為腸道的閉阻不通，如便秘和結(jié)扎直腸等模型，許紅等復(fù)制大鼠直腸半結(jié)扎模型，觀察心、肝、腎、肺和腸等器官的形態(tài)學(xué)改變，觀察肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)變化以及大承氣湯的干預(yù)效果，結(jié)果證明了腸道病變可引起特異性的肺臟損害；通過(guò)治療腸道病變，肺部的損害隨之減輕，從而側(cè)面印證了中醫(yī)“肺合大腸”臟腑相關(guān)理論，肺－腸病理生理存在一定的相關(guān)性及互動(dòng)調(diào)節(jié)現(xiàn)象［4］。葉建紅等通過(guò)建立便秘大鼠模型探討肺腸的微生態(tài)，結(jié)果表明模型組結(jié)腸和肺組織的菌群類型及數(shù)量都有不同程度的變化［5］。另一類大腸的傳導(dǎo)失司，如炎癥性腸病模型和脾陽(yáng)虛的泄瀉模型等。如方亞利等以葡聚糖硫酸鈉（DSS）建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，并檢測(cè)呼吸道分泌液中sIg A含量，結(jié)論顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［6］。孫小云等［7］運(yùn)用通腑湯觀察急性肺損傷（AII）大鼠腸組織中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的影響，結(jié)論顯示腸組織中CGRD降低明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。都從不同的方面探討了肺與大腸的相互關(guān)系。

2 模型的建立

2.1 造模方案 取體重（180～220）g健康SD大鼠，雄性，共70只。按體重隨機(jī)分成空白對(duì)照（30只），模型組（30只）和治療組（10只）。所有大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組及治療組大鼠均以2.4%水合氯1.0～1.2 mL／100 g腹腔注射麻醉后，在石蠟油潤(rùn)滑下，經(jīng)腸道輕緩插入輸液管至距肛8 c m處，將100 mg／kg TNBS（三硝基苯磺酸）加入等體積50%乙醇，注入大鼠結(jié)腸，然后注入約0.5 mL空氣，將大鼠尾部向上輕提45°放置1 min，然后保持平躺自然清醒?？瞻讓?duì)照組大鼠按上述方法給予等量生理鹽水灌腸；分別在造模第2周、第5周、第8周，隨機(jī)抽取正常對(duì)照組和模型組大鼠各10只，隨機(jī)抽取空白對(duì)照組和模型組大鼠各10只，以2.4%水合氯醛1.0～1.2 mL／100 g腹腔注射麻醉并處死測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)［8～10］。治療組于第5周選用三拗湯于TNBS造模后行灌胃治療，至第8周統(tǒng)一處死。

2.2 測(cè)定內(nèi)容 一般情況，觀察大鼠的精神，進(jìn)食，活動(dòng)，體重等情況，取正常組和對(duì)照組結(jié)腸和肺部組織，制作病理切片HE染色后顯微鏡下觀察結(jié)腸和肺部組織病理變化。從免疫方面探討肺和大腸的相關(guān)性，采用雙抗體夾心ABC一ELLSA法，測(cè)定結(jié)腸和肺組織IL－1、TNF－α水平變化［6］。

3 模型討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 選取的要點(diǎn)是能反應(yīng)大腸與肺之間的聯(lián)系［11］，前以論述肺與大腸相表里的關(guān)系紐帶主要是水液和氣機(jī)，孔小云等從水液代謝角度探討肺與大腸的關(guān)系［12］。本實(shí)驗(yàn)擬從大腸傳導(dǎo)失司，來(lái)探討對(duì)肺的輸布，運(yùn)化的作用的影響，采用TNBS建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。其優(yōu)點(diǎn)：（1）TNBS建立結(jié)腸炎模型以其，價(jià)格不高，重復(fù)性好，病理變化和人體相似，故應(yīng)用廣泛，依據(jù)較高。（2）結(jié)腸炎模型引起的癥狀，主要為腹瀉，腸道病理?yè)p壞為特征。符合腸病的損壞導(dǎo)致腸道失司，氣化不利這一特征。符合能否反映對(duì)肺影響的這一特點(diǎn)。

3.2 模型大鼠處死時(shí)間的選擇 TNBS屬于半抗原，單獨(dú)在體內(nèi)不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，只有在與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合后才能誘發(fā)免疫反應(yīng)，造模時(shí)需用乙醇作為腸黏膜屏障的破壞劑［13～14］，使TNBS與腸黏膜角蛋白結(jié)合成全抗原，從而激發(fā)局部免疫反應(yīng)。而對(duì)其機(jī)體的影響，王皓等報(bào)道稱，潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型病理變化在第1～3周為急性期改變，以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主；第4～8周為慢性炎癥改變，浸潤(rùn)細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞［15］?？紤]到腸病及肺的傳變，假設(shè)在傳變的過(guò)程中需要時(shí)間，故選擇時(shí)間擬定在2.5.8周，這樣做的優(yōu)點(diǎn)是能較全面反應(yīng)TNBS在大鼠整個(gè)周期的影響，利于觀察肺腸之間的相關(guān)性，且能評(píng)估對(duì)肺部的影響程度。

3.3 關(guān)于IL－1、TNF－α的選取 UC的發(fā)病機(jī)制雖未完全明確，但是免疫因素在其中具有重要的意義，研究發(fā)現(xiàn)，UC病變黏膜局部巨噬細(xì)胞活化，釋放一系列細(xì)胞因（IL－1、IL－6、IL－8、TNF－α），活動(dòng)性UC血清、結(jié)腸黏IL－1、TNF－α膜中TNF－α、IL－6、IL－8水平均明顯升高，其結(jié)腸黏膜中TNF－αIL－6及IL－8的mRNA表達(dá)明顯增加，這些細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌均與疾病的炎癥程度呈正相關(guān)。IL－6、IL－8、IL－1和TNF－α等促炎癥細(xì)胞因子已是公認(rèn)的能介導(dǎo)UC發(fā)病的細(xì)胞因子［16］。孫慧怡等［17］探討IBD患者血清TNF－α和IL－8水平與疾病活動(dòng)度的關(guān)系，結(jié)果UC和CD活動(dòng)期患者TNF－α和IL－8血清水平均高于緩解期患者及正常組，IBD患者血清TNF－α和IL－8水平升高，并參與了腸黏膜組織的炎癥損傷。

3.4 三拗湯 《太平惠民和劑局方》由麻黃，杏仁，甘草組成，主要運(yùn)用于外感風(fēng)寒，肺氣不宣證。鼻塞聲重，語(yǔ)音不出，咳嗽胸悶。臨床中運(yùn)用只宣發(fā)肺氣來(lái)治療腸病的案例很少，多通過(guò)肺腸合治來(lái)達(dá)到治療效果，李亞玲［18］運(yùn)用以桑白皮，黃芩等治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎，雖然也有宣肺的功效，從實(shí)質(zhì)來(lái)講，也屬清熱解毒之品，鄭舜華［19］采用補(bǔ)肺益腸法治療潰瘍性結(jié)腸炎，從病久及虛，病久及瘀的觀點(diǎn)入手，用黨參，黃芪，桑白皮，血竭等藥物進(jìn)行了大鼠實(shí)驗(yàn)，張永艷［20］運(yùn)用宣肺健脾湯治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎，均豐富了肺腸的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)旨在考慮通過(guò)治肺對(duì)肺部水液氣機(jī)和宣散，在微觀上觀察對(duì)腸病的影響，在病理解剖上可能達(dá)不到客觀標(biāo)準(zhǔn)，但TNF－α和IL－8含量與模型組相比有差異則意義重大。

此外，本實(shí)驗(yàn)尚有考慮不足之處，如實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠駮?huì)隨著TNBS對(duì)模型損害的逐漸恢復(fù)而造成肺部指標(biāo)隨之改變，從而影響實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)意義。免疫指標(biāo)較少，不能較為完全的反應(yīng)對(duì)免疫方面的影響，可酌情增加指標(biāo)，或從神經(jīng)肽方面如免疫組化的SP，VIP物質(zhì)等進(jìn)行相關(guān)性探索。

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