甲床細胞體外培養(yǎng)的實驗研究

高 峰，陳世玖，張麗杰，倪少俊，楊 軍，李 智

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院手外、整形科，廣東珠海519100)

指甲再生來源于甲根和甲弧影下方的甲床，此處的甲床稱為甲母質(zhì)。甲床提供指甲向遠端生長的滑面，當(dāng)甲床受損后，新生的指甲會出現(xiàn)不整齊現(xiàn)象而影響美觀。因此，臨床工作者們不懈地努力研究，不同類型的甲床損傷采用何種方式修復(fù)，術(shù)后能達到理想的效果。隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，可根據(jù)情況選擇不同的方法，完善了甲床損傷的治療，如游離甲床移植術(shù)、皮瓣修復(fù)術(shù)、游離甲瓣修復(fù)術(shù)等。近些年，對甲床基礎(chǔ)的研究相對較少，本實驗旨在為深入研究甲床細胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甲床上皮細胞組織塊

培養(yǎng) 收集一名臨床志愿者因經(jīng)?？漆t(yī)師檢查及超聲波檢查后發(fā)現(xiàn)胎兒死在宮內(nèi)，進行立即引產(chǎn)，取得胎兒手指(經(jīng)本人和家屬知情同意)。將20周以上胎兒手指放入70%乙醇中浸泡5 min，取出后用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。超凈工作臺內(nèi)4倍手術(shù)放大鏡下，切取甲床，放入含雙抗的磷酸鹽緩沖液中備用。將切取的甲床組織在培養(yǎng)皿內(nèi)用眼科剪將其剪切成1 mm2的小塊，均勻地平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶底部，組織塊與組織塊之間保持0.5 cm左右的距離，加入無血清角化細胞培養(yǎng)基，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 h，待組織塊黏著牢固時，加入0.001～0.002 L培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液慢慢浸潤組織塊，再輕輕且緩慢翻轉(zhuǎn)正置培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基剛好浸過組織塊平面，以不令組織塊漂起為標準。再于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24～48 h后補加培養(yǎng)液0.002～0.003 L，培養(yǎng)的前2 d應(yīng)避免過多觀察和晃動培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。以后每天觀察組織塊的變化，21 d仍無細胞生長者予以淘汰。

1.2 甲床成纖維細胞組織塊培養(yǎng) 收集、獲得組織塊及培養(yǎng)方法同1.1段所述。采用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3 細胞鑒定 甲床上皮細胞檢測角蛋白17，免疫組織化學(xué)染色法，按試劑盒操作說明進行。成纖維細胞免疫熒光顯微鏡檢測波形蛋白表達方法按公司產(chǎn)品說明書并按參考文獻［1］進行。

2 結(jié)果

2.1 甲床細胞生長情況

2.1.1 甲床上皮細胞 倒置顯微鏡觀察，2～3 d左右從組織塊中游出，并在組織塊周圍形成生長暈，能游出細胞的組織塊占貼附組織塊的比例約1/3，13 d左右細胞生長密度可達瓶底的70%～80%，扁圓形或多角形細胞，呈鋪路石樣排列，其數(shù)目可達1×1010～1 ×1011個/L。

2.1.2 甲床成纖維細胞 2 d可見組織塊周圍有的細胞游離出來，呈放射狀，3 d觀察可見組織塊周圍有許多生長的細胞，呈圓梭形、長梭形、多角形等成纖維細胞的特征，胞體豐富，胞質(zhì)均勻，細胞核清晰可見，11 d左右細胞生長密度可達瓶底的70%～80%。其數(shù)目可達1×1010～1×1011個/L。

2.2 甲床細胞的免疫細胞化學(xué)鑒定 培養(yǎng)的甲床上皮細胞70%以上特異性角蛋白17抗體染色陽性，證明培養(yǎng)的細胞為甲床上皮細胞;培養(yǎng)的甲床成纖維細胞抗波形蛋白抗體染色陽性，說明培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。

3 討論

指(趾)甲和甲床作為皮膚的附屬組織，具有與皮膚不同的組織結(jié)構(gòu)，并由此具有特殊的功能，如對指功能和美容作用等。指(趾)甲由外胚層分化而來。第13周時，發(fā)育中的甲單位的上皮能夠分成四層:基底層、棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層，被稱為甲床上皮。在20周時甲板完全覆蓋甲床，并且甲床上皮完全失去顆粒層，此時，胎兒的甲與成人的甲基本相似。所以，本研究選擇此時期胎兒甲床作為標本。甲床兩種主要功能細胞，分別為上皮細胞和成纖維細胞，它對甲床的再生及形態(tài)的維持，起重要作用。

原代細胞的獲取，有組織塊培養(yǎng)法及消化法兩種。由于大多數(shù)情況下難以獲得大量的甲床標本，可以根據(jù)標本的大小來決定培養(yǎng)方法［2］。如果獲得的標本較大，應(yīng)用胰酶消化法;在獲得的標本較小的情況下，則應(yīng)用組織塊法培養(yǎng)。甲床上皮細胞屬于角化細胞，貼壁生長相對困難，為了促進角化細胞貼壁，不同學(xué)者采用過不同的方法。Nagae等［2］應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床細胞成功，證明角化細胞培養(yǎng)液是甲床細胞的良好培養(yǎng)基。劉東昕等［3］采用胰酶消化法及應(yīng)用無血清角化細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床上皮細胞，獲得成功。De Berker等［4］證實了甲基質(zhì)部位上皮細胞增殖旺盛，是甲板的主要來源。

細胞角蛋白只在上皮細胞或外胚層起源的細胞中表達，在不同細胞中有不同亞型表達［5］。角蛋白是上皮細胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白和分化的標志產(chǎn)物。角蛋白分為兩大類，即皮膚型角蛋白和毛發(fā)角蛋白。皮膚型角蛋白主要表達于皮膚等部位，毛發(fā)型角蛋白主要表達于毛發(fā)、指甲等部位。Berker等［6］的實驗表明，在甲床的上皮細胞中表達K17蛋白?？筀17免疫組織化學(xué)染色，證實甲床上皮細胞，同時也說明甲床上皮細胞在體外培養(yǎng)條件下，蛋白的表達沒有明顯改變。劉東昕等［3］也通過實驗研究應(yīng)用抗K17免疫組織化學(xué)染色，證實甲床上皮細胞。

本實驗應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)出甲床上皮細胞及甲床成纖維細胞，也證實了甲床上皮細胞在無血清角化細胞培養(yǎng)液中生長良好。雖與酶消化法相比，獲取細胞時間上相多較長，但組織塊法為傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法，容易操作，成功率高。而酶消化法的濃度及消化時間難以掌握，不易獲取，實驗成功率低。組織塊培養(yǎng)時應(yīng)注意以下幾點:①實驗材料要新鮮，從活體分離材料后要低溫保存，并盡快進行細胞分離實驗;②遵守細胞培養(yǎng)的無菌操作;③分離細胞時，注意動作要輕柔，不要傷到細胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利于細胞游離;④培養(yǎng)過程中避免組織塊干燥脫水;⑤2 d內(nèi)避免過多觀察和晃動培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。

甲床缺損是常見的手外傷類型，隨著顯微外科的發(fā)展，臨床工作者在不斷尋求甲床修復(fù)的最佳方法。雖然現(xiàn)在甲床修復(fù)方式較多，仍存較多缺點，如游離指(趾)甲床移植再造手指甲床，成活后指甲形態(tài)較美觀，卻會失去另一個相對次要的指(趾)甲;游離甲瓣修復(fù)術(shù)，可使傷指再生指甲、恢復(fù)手指感覺，卻需要一個足趾付出較大的代價。所以不管采用何種修復(fù)方法，均存在一定弊端。如果體外構(gòu)建組織工程甲床成功，將會避免以損害其他組織為代價。本研究體外培養(yǎng)甲床細胞成功，為進一步構(gòu)建組織工程甲床奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Aicher A，Heeschen C，Mohanpt M，et al.Nicotine strongly activatesdendritic cell-mediated adaptive immunity-potential role for progressionof atherosclerotic lesions［J］.Circulation，2003，107 (4):604-611.

［2］ Nagae H，Nakanishi H，Urano Y，et al.Serial cultivation of human nail matrix cells under serum-free conditions［J］.J Dermatol，1995，22(8):500-566.

［3］ 劉東昕，路來金，王虎.胰酶分次消化及無血清角化細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床上皮細胞的體外實驗［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10 (5):40-41.

［4］ De Berker D，Angus B.Proliferative compartments in the normal nail unit［J］.Br J Dermatol，1996，135(4):555-559.

［5］ Carmona FD，Ou J，Jiménez R，et al.Development of the cornea of truemoles morphogenesis and expressionof PAX6 and cytokeratins［J］.J Anatomy，2010，217(5):488-500.

［6］ De Berker D，Wojnarowska F，Sviland L，et al.Keratin expression in the normalnail unit:markers of regional differentiation［J］.Br J Dermatol，2000，142(1):89-96.