噬菌體展示技術(shù)在漢坦病毒研究中的應(yīng)用

楊棟強綜述，白雪帆審校

綜述

噬菌體展示技術(shù)在漢坦病毒研究中的應(yīng)用

楊棟強綜述，白雪帆審校

噬菌體展示技術(shù)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，在研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、抗原抗體之間的相互作用、新藥開發(fā)、疾病診斷、疫苗研制以及病毒研究等方面具有廣泛應(yīng)用。文中就噬菌體展示技術(shù)在漢坦病毒研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

噬菌體展示技術(shù);漢坦病毒;多肽

0 引 言

噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)始創(chuàng)于1985年。Smith等［1］首次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，創(chuàng)建了該技術(shù)。自1990年Scott等［2］將噬菌體隨機(jī)多肽庫應(yīng)用于篩選抗原表位以來，已進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，有力地推動了病毒抗原表位的研究進(jìn)程。1994年McCaffery等［3］最先構(gòu)建了噬菌體多肽和抗體展示文庫，開始了噬菌體展示技術(shù)廣泛應(yīng)用的新時代。20余年來，噬菌體展示技術(shù)已應(yīng)用于抗體的制備、多肽及蛋白質(zhì)和酶的制備等多個生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

漢坦病毒(Hantavirus)感染可引起2種人類急性傳染病，即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)［4］。全世界每年約有15萬HFRS和HPS患者，病死率視感染的病毒型別而異，自0.1%～40%不等，其中HPS最高［5－7］。我國是世界上受HFRS危害最為嚴(yán)重的國家，自1949年至2010年年末，已累計報告HFRS發(fā)病近160萬人，占同期世界總病例數(shù)83.75%以上［8］。漢坦病毒可作為重要的生物戰(zhàn)劑應(yīng)用于軍事。對漢坦病毒及其相關(guān)疾病的防治研究已取得了很大進(jìn)展，但其發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全明確，也無特效的治療措施，安全有效的減毒活疫苗或基因工程疫苗尚待開發(fā)。由于噬菌體展示技術(shù)在篩選病毒抗體和抗原表位方面的獨特優(yōu)勢，在漢坦病毒的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面得到了較為廣泛的應(yīng)用，本文就此作一綜述。

1 噬菌體展示技術(shù)的原理和特點

1.1 噬菌體展示技術(shù)原理 噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)篩選技術(shù)，該項技術(shù)將編碼多肽的DNA片段與噬菌體表面蛋白的編碼基因重組后，以融合蛋白的形式在噬菌體表面表達(dá)出多肽序列，實現(xiàn)對表型和基因型的同時研究。將化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸序列插入噬菌體基因組，在噬菌體表面表達(dá)出各種氨基酸組合的短肽，通過與特定的靶標(biāo)反應(yīng)，從表達(dá)有各種外源性蛋白的噬菌體肽庫中篩選出展示特定蛋白的噬菌體。通過感染大腸桿菌使選擇出的噬菌體擴(kuò)增，然后進(jìn)行序列測定，獲得相應(yīng)的結(jié)構(gòu)和功能信息，實現(xiàn)了高通量篩選。噬菌體展示技術(shù)是有效的分子篩選方法，在研究蛋白質(zhì)間相互作用、尋找酶和受體的激動劑和拮抗劑、研制新型診斷試劑和疫苗以及在抗腫瘤和抗感染藥物研究等方面均有重要價值。噬菌體展示系統(tǒng)因載體和宿主細(xì)胞不同分為絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)及T4噬菌體展示系統(tǒng)。目前主要的庫類型有包括噬菌體抗體庫、隨機(jī)短肽庫、多肽構(gòu)象庫、cDNA展示庫、基因突變體展示庫等［9－11］。

1.2 噬茵體展示技術(shù)的特點 噬菌體展示技術(shù)簡單易行，采用經(jīng)典的PCR分子克隆等技術(shù)即可操作，在數(shù)周內(nèi)即可篩選106～108個克隆，篩選獲得的抗體庫可用于原核系統(tǒng)表達(dá)，無需組織培養(yǎng)，極大地降低了成本。通過噬菌體展示技術(shù)制備的抗體庫抗體多數(shù)是抗原結(jié)合片段(Fab片段)或單鏈抗體(ScFv)，對抗體的親和力有一定的影響，但如對某些抗體基因進(jìn)行改造，同樣可以獲得親和力強的抗體。篩選獲得噬菌體隨機(jī)肽庫具有容量大、體積小、篩選簡便、制備成本低、可多次擴(kuò)增等突出優(yōu)點。展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面，是探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探測未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的有利工具，在蛋白分子相互識別的研究、新型疫苗的研制、以及藥物的開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景［12－13］。

2 噬菌體展示技術(shù)在漢坦病毒研究中的應(yīng)用

2.1 抗原表位檢測 抗原表位的研究一直是微生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點。上世紀(jì)末，研究者重視病毒抗原表位的深入研究，為了尋求簡捷而可靠的探索途徑和方法，發(fā)現(xiàn)并建立了噬菌體展示技術(shù)。經(jīng)過多年的發(fā)展和完善，完全能夠作為抗原表位研究的操作簡便、高通量、低成本和可調(diào)控的實用性平臺。而且，在眾多類型載體中，絲狀噬菌體PⅢ蛋白N端容納的外源蛋白與抗原表位大小匹配［14］，這種“不謀而合”足以避免表位研究中的“節(jié)外生枝”，因而更適合于表位信息肽庫的構(gòu)建。噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用，使?jié)h坦病毒抗原表位的篩選和鑒定以及小分子多肽疫苗的研究步入了快速發(fā)展階段。

白雪帆等［15－16］用多株具有不同反應(yīng)譜的國產(chǎn)單克隆抗體對呈現(xiàn)在噬菌體表面的漢坦病毒76－118株隨機(jī)核衣殼蛋白多肽片段進(jìn)行了免疫篩檢，結(jié)果表明漢坦病毒N端從讀框內(nèi)啟始密碼(第1個氨基酸)起至第86位氨基酸的范圍內(nèi)為該病毒的主要的線性表位，該表位可被我國學(xué)者制備的廣譜(組特異性)單抗L13F3 BI1和型特異性單抗5H5 (野鼠型)及R31(家鼠型)所識別。此外還發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒核衣殼蛋白氨基端表位的抗原強度與其大小成正比。為病毒分子生物學(xué)研究和診斷抗原的研制提供了重要的資料。對本研究證實的表位進(jìn)行深入研究有可能進(jìn)一步從分子水平上揭示漢坦病毒的抗原和功能特性。

李光玉等［17］應(yīng)用型特異性單克隆抗體5H5淘篩噬菌體隨機(jī)9肽庫，找到了該株單抗識別的較小的多肽表位。并證實了HTNV N端1～86位氨基酸的范圍，是該病毒的主要線性表位，從分子水平上加深了對HTNV NP表位的認(rèn)識，為免疫診斷和小分子多肽疫苗的合理設(shè)計提供了有價值資料。該研究結(jié)果也進(jìn)一步證明，噬菌體隨機(jī)肽庫是篩選病毒抗原表位的有效和可靠的工具。王長軍等［18］用噬菌體展示技術(shù)通過3～4輪生物淘選，篩選到與單抗F3特異性結(jié)合的陽性克隆，氨基酸序列均為MHG-PTKNQMWHT，并且與漢坦病毒M蛋白G2區(qū)第750～759位氨基酸具有較高的同源性，進(jìn)一步的動物試驗表明，所得肽段是天然病毒抗原較好的免疫原模擬肽，為根據(jù)表位制備漢坦病毒多肽疫苗及DNA疫苗提供了材料。

2.2 漢坦病毒抗體的研究 病毒抗體被廣泛用于病毒診斷和被動免疫治療。目前用于檢測病毒的抗體主要來源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，在篩選單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是長期復(fù)雜的過程，費時費力。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)，徹底改變了真菌毒素抗體及抗原制備的傳統(tǒng)途徑，利用此技術(shù)可篩選到親和力和特異性都令人滿意的并且修飾過的抗體。噬菌體抗體庫有3種類型，即天然抗體庫、合成抗體庫和免疫抗體庫。噬菌體技術(shù)發(fā)展至今，已可在2周內(nèi)根據(jù)靶分子篩選出相應(yīng)的具有高親和力的抗體。

白雪帆等［19］用DNaseⅠ隨機(jī)降解漢坦病毒76－118株S基因，回收50～300 bp的DNA片段，與克隆接頭連接后插人經(jīng)SfiⅠ線性化的噬菌體載體fuse5，電穿孔導(dǎo)入MC1061菌建庫。轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)擴(kuò)增后提取重組噬菌體，感染K91細(xì)胞測定庫容，并隨機(jī)挑選若干克隆測序。對文庫的粗測表明該文庫基本可以滿足抗體篩檢實驗的要求。侯穎春等［20］以3種方法從出血熱恢復(fù)期患者外周血淋巴細(xì)胞成功地擴(kuò)增出人抗體v區(qū)3種基因片段(VH，VK，Vλ)，通過搭橋拼接延伸反應(yīng)(SOE)。以(Gly4Ser)3為連接子，將重、輕鏈v區(qū)基因連接成為VH-Linker-VK和VH-Linker-Vλ兩種單鏈抗體(ScFv)基因。然后將SeFv基因與載體pHEN1重組，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌TG1，通過輔助噬菌體M13KO7的超感染，制備成兩種噬菌體展示人源性全套ScFv抗體文庫，為從噬菌體抗件庫中篩選所需抗體基因進(jìn)行測序和表達(dá)提供了基礎(chǔ)。

Koch等［21］從感染漢坦病毒康復(fù)期患者的外周血淋巴細(xì)胞中用逆轉(zhuǎn)錄和PCR方法構(gòu)建抗體庫，繼而用完整的漢坦病毒76－118株為靶分子，從構(gòu)建的抗體庫中篩選病毒特異性抗體，經(jīng)過3輪淘洗后，篩選出5株與漢坦病毒有較強結(jié)合能力的抗體，將這5株抗體重組表達(dá)后研究發(fā)現(xiàn)全部具有中和漢坦型和漢城型病毒(Seoul virus)的功能，其中3株還能中和多布拉伐病毒(Dobrava virus)。深入研究發(fā)現(xiàn)這些抗體可以識別漢坦病毒G2蛋白上的2個表位916-KVMATIDSF-924和954-LVTK-DIDFD-963，該表位對于病毒入侵宿主細(xì)胞至關(guān)重要，對HFRS的預(yù)防和治療研究具有借鑒價值。

2.3 篩選抗?jié)h坦病毒多肽 時至今日，國際權(quán)威的美國食品藥品監(jiān)督管理局仍未批準(zhǔn)包括利巴韋林等任何針對漢坦病毒相關(guān)疾病如HFRS和HPS的特效治療藥物［22］。因此，探討漢坦病毒感染致病的分子機(jī)理，尋找有效的抗病毒治療藥物仍是當(dāng)前及今后HFRS防治的重要任務(wù)?？刮⑸镫氖墙臧l(fā)現(xiàn)的新型生物活性分子。短肽或寡肽類分子具有分子量小、穿透力強、抗原性弱、活性強、易于制備且容易與靶分子結(jié)合等優(yōu)點，是當(dāng)前癌腫和感染等治療極好的靶向藥劑。功能性多肽的篩選工作量十分浩大，需要高通量的篩選技術(shù)，而噬菌體展示技術(shù)可滿足該項工作的需要。噬菌體展示技術(shù)是選擇技術(shù)，使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過一種稱為淘選(biopanning)的體外選擇程序得以快速鑒定。由于噬菌體表面展示的多肽能夠與靶分子結(jié)合，因而可以通過親和篩選從噬菌體多肽庫中篩選出與靶分子特異性結(jié)合的多肽，即讓多肽模擬配體的結(jié)合部位與靶分子結(jié)合，測得配體與受體的結(jié)合位點，多肽序列則可以通過測定噬菌體所插入的外源DNA序列而得知［23－26］。

Larson等［27］應(yīng)用αvβ3分子對展示環(huán)狀九肽的噬菌體肽庫進(jìn)行淘篩，發(fā)現(xiàn)了70個可與β3整合素結(jié)合的九肽，這些肽可以不同程度地減少漢坦病毒屬中的辛諾柏型病毒(Sin Nombre virus，SNV)和漢灘型病毒(Hantaan virus，HTNV)的空斑形成數(shù)。經(jīng)比較證實其中8個短肽與SNV的囊膜糖蛋白具有較高的同源性。作者合成了其中4個肽段，證明部分肽段的組合可提高阻斷SNV病毒感染的效果，為進(jìn)一步設(shè)計和獲取更高活性的抗?jié)h坦病毒短肽提供了重要資料［28］。Hall［29］等針對安第斯病毒(andes virus，ANDV)表面囊膜糖蛋白Gn和GC應(yīng)用抗體競爭性洗脫9肽庫，所得噬菌體完成了體外阻止ANDV的活性實驗，在此基礎(chǔ)上嘗試合成了相應(yīng)的多肽序列，其中3個肽段顯示出明顯的病毒抑制作用。這些肽段的發(fā)現(xiàn)為抗?jié)h坦病毒多肽類藥物的研究提供了基礎(chǔ)。

3 結(jié) 語

噬菌體展示技術(shù)出現(xiàn)只有20余年的歷史，如許多其他新技術(shù)一樣，該項技術(shù)也存在自身的難點和問題，有些甚至是未曾預(yù)料到的。但隨著其應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，不斷地得到完善。噬菌體展示技術(shù)在漢坦病毒研究中的應(yīng)用必將增進(jìn)人類對漢坦病毒的認(rèn)識。近年研究表明β3整合素是漢坦病毒的關(guān)鍵受體，封閉或阻斷β3整合素已成為抗?jié)h坦病毒治療研究的重要策略［30］。通過對噬菌體展示短肽庫的篩選，獲得能夠特異高效拮抗?jié)h坦病毒感染的肽段，并進(jìn)一步通過特定肽段的改構(gòu)和不同組合提高其抗病毒活性，有助于研制新型抗?jié)h坦病毒多肽類藥物。

［1］ Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface［J］.Science，1985，228(4705):1315-1317.

［2］ Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitope library［J］.Science，1990，249(4967):386-390.

［3］ Henry R，Kapazoglou A，McCaffery M，et al.Differences between lumen targeting domains of chloroplast transit peptides determine pathway specificity for thylakoid transport［J］.J Biol Chem，1994，269(14):10189-10192.

［4］ Schmaljohn C，Hjelle B.Hantaviruses:a global disease problem［J］.Emerg Infect Dis，1997，3(2):95-104.

［5］ Guzman GP，Tapia EO，Villaseca HM，et al.Morphological findings in fatal cases of hantavirus cardiopulmonary syndrome.Report of 7 autopsies［J］.Rev Chilena Infectol，2010，27(5):398-405.

［6］ Borges A，F(xiàn)igueiredo LT.Mechanisms of shock in hantavirus pulmonary syndrome［J］.Curr Opin Infect Dis，2008，21(3):293-297.

［7］ Lapinsky SE.Epidemic viral pneumonia［J］.Curr Opin Infect Dis，2010，23(2):139-144.

［8］ Lee HW，Calisher C，Schmaljohn C.Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome［M］.Seoul:Asian Institute for Life Sciences.1999:1-6.

［9］ 徐 海，王繼春，于 轍，等.利用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選可結(jié)合豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的多肽序列［J］.微生物學(xué)報，2011，51(1):127-133.

［10］ Govarts C，Somers K，Stinissen P，et al.Frameshifting in the p6 cDNA phage display system［J］.Molecules，2010，15(12): 9380-9390.

［11］ Lin M，McRae H，Dan H，et al.High-resolution epitope mapping for monoclonal antibodies to the structural protein Erns of classical swine fever virus using peptide array and random peptide phage display approaches［J］.J Gen Virol，2010，91(Pt 12):2928-2940.

［12］ Gershoni JM，Roitburd-Berman A，Siman-Tov DD，et al.Epitope mapping:the first step in developing epitope-based vaccines［J］.Biodrugs，2007，21(3):145-156.

［13］ Ladner RC，Sato AK，Gorzelany J，et al.Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies［J］.Drug Discov Today，2004，9(12):525-529.

［14］ Benhar I.Biotechnological applications of phage and cell display［J］.Biotechnol Adv，2001，19(1):1-33.

［15］ 白雪帆，汪 毅，潘 蕾，等.漢灘病毒核衣殼蛋白主要B細(xì)胞表位的識別及其基因定位［J］.中華傳染病雜志，1999，17(4):245-249.

［16］ 白雪帆，黃長形，汪 毅，等.應(yīng)用噬菌體肽庫技術(shù)對漢灘病毒核衣殼蛋白N端主要線性抗原位點的識別及其基因定位［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，19(6):709-710.

［17］ 李光玉，白雪帆，潘 蕾，等.應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)肽庫淘篩mAb 5H5識別的抗原表位［J］.中國病毒學(xué)，2001，16(4): 386-389.

［18］ Wang CJ，Tang JQ，Tao KH，et al.Screening and identification of mimic epitopes of monoclonal antibodies against hantaan virus using phage display technique［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2004，20(4):429-432.

［19］ Bai XF，F(xiàn)ack F，Hang CS，et al.Construction of phage peptide library for hantaan virus nucleocapsid protein［J］.J Cell Mol Immuno1，1999，15(1):1-5.

［20］ 侯穎春，白雪帆，楊為松，等.出血熱恢復(fù)期患者全套噬菌體抗體庫的構(gòu)建［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1997，13(4): 7-11.

［21］ Koch J，Liang M，Queitsch I，et al.Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein［J］.Virology，2003，308(1):64-73.

［22］ Jonsson CB，Milligan BG，Arterburn JB.Potential importance of error catastrophe to the development of antiviral strategies for hantaviruses［J］.Virus Res，2005，107(2):195-205.

［23］ Baneyx F，Schwartz DT.Selection and analysis of solid-binding peptides［J］.Curr Opin Biotechnol，2007，18(4):312-317.

［24］ Habich C，Kempe K，van der Zee R，et al.Heat shock protein 60:specific binding of lipopolysaccharide［J］.J Immunol，2005，174(3):1298-1305.

［25］ Wood KC，Azarin SM，Arap W，et al.Tumor-targeted gene delivery using molecularly engineered hybrid polymers functionalized with a tumor-homing peptide［J］.Bioconjug Chem，2008，19(2):403-405.

［26］ Daniels DA，Lane DP.Phage peptide libraries［J］.Methods，1996，9(3):494-507.

［27］ Larson RS，Brown DC，Ye C，et al.Peptide antagonists that inhibit Sin Nombre virus and hantaan virus entry through the beta3-integrin receptor［J］.J Virol，2005，79(12):7319-7326.

［28］ Hall PR，Malone L，Sillerud LO，et al.Characterization and NMR solution structure of a novel cyclic pentapeptide inhibitor of pathogenic hantaviruses［J］.Chem Biol Drug Des，2007，69 (3):180-190.

［29］ Hall PR，Hjelle B，Njus H，et al.Phage display selection of cyclic peptides that inhibit Andes virus infection［J］.J Virol，2009，83(17):8965-8969.

［30］ Song JW，Song KJ，Baek LJ，et al.In vivo characterization of the integrin beta3 as a receptor for Hantaan virus cellular entry［J］.Exp Mol Med，2005，37(2):121-127.

Application of phage display technology in Hantaan virus research

YANG Dong-qiangreviewing，BAI Xue-fanchecking
(Center of Infectious Diseases，Tangdu Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi＇an710038，Shaanxi，China)

Phage display is a new technique for the research of protein-protein or antigen-antibody interactions，new drug development，diagnosis of disease，vaccine design and virus research in recent years.This article reviews the current application of this technology in Hantaan virus research.

Phage display;Hantaan virus;Peptide

Q939.48

A

1008-8199(2012)07-0767-04

國家自然科學(xué)基金(30872215)

710038西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病中心［楊棟強(醫(yī)學(xué)碩士研究生，現(xiàn)在河南省人民醫(yī)院感染科工作)、白雪帆］

白雪帆，E－mail:xfbai@fmmu.edu.cn

2011-10-31;

2011-12-07)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:郭聯(lián)慶)