牙齒酸蝕癥實(shí)驗(yàn)室評(píng)估技術(shù)的研究進(jìn)展

袁 鶴 綜述;李繼遙 審校

(四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041)

牙齒酸蝕癥(tooth erosion)是指在無細(xì)菌參與的情況下，由于單純的化學(xué)作用而引起的牙齒硬組織不可逆的喪失［1］，其致病機(jī)制尚未完全明了，可由外源性和內(nèi)源性因素造成。外源性致病因素包括食用酸性物質(zhì)、飲料、食物、藥物和酸性環(huán)境的暴露;內(nèi)源性致病因素包括胃內(nèi)容物返流引起的復(fù)發(fā)性嘔吐等全身性疾?。?－4］。此外，宿主的生物學(xué)因素，如唾液、獲得性膜的形成、牙齒的結(jié)構(gòu)、牙齒與軟組織的關(guān)系以及舌的運(yùn)動(dòng)等也可能影響牙齒酸蝕癥的發(fā)生發(fā)展［5］。當(dāng)前的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究均證明，大量飲用軟飲料能增加牙齒酸蝕癥發(fā)生的危險(xiǎn)性［6－14］。牙齒酸蝕癥病人最初往往僅有牙齒的感覺過敏，以后逐漸產(chǎn)生實(shí)質(zhì)缺損，酸蝕的形式因酸而異［15］。不同學(xué)者對(duì)牙齒酸蝕癥的臨床表現(xiàn)看法不一，Ganss［16］對(duì)目前根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷牙齒酸蝕癥的有效性進(jìn)行分析后指出:前牙的溝槽狀缺損不能用于診斷牙齒酸蝕癥;釉牙骨質(zhì)界冠方淺碟狀缺損以及存在于青年人牙尖的杯狀凹陷性缺損可以作為診斷牙齒酸蝕癥的依據(jù)。

牙齒酸蝕癥的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估主要是通過測(cè)量酸蝕過程中牙齒硬組織或羥磷灰石的喪失來提示酸蝕介質(zhì)的酸蝕潛力(erosive potential)。酸蝕潛力與酸蝕介質(zhì)的多種因素有關(guān)，如pH值，緩沖能力(即滴定酸度)，對(duì)牙面的粘著性，螯合性，鈣、磷、氟等礦物質(zhì)離子的濃度等［5］。因此，評(píng)估方法也眾多，本文就其實(shí)驗(yàn)室評(píng)估技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 化學(xué)方法(Chemical analysis)

是一種通過測(cè)量酸蝕介質(zhì)處理標(biāo)本前后pH值、緩沖能力、Ca2+或磷酸根濃度以及某些微量元素的變化，以評(píng)估酸蝕潛力的方法。具體方法是將牙齒硬組織或羥磷灰石暴露于酸蝕介質(zhì)一段設(shè)定的時(shí)間后，對(duì)酸蝕介質(zhì)進(jìn)行分析，測(cè)量前后的濃度變化越大說明酸蝕潛力越強(qiáng)。

化學(xué)方法評(píng)估酸蝕潛力簡單易行，無需制備標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)成本低，可實(shí)時(shí)比較不同處理時(shí)間下各種酸蝕介質(zhì)的酸蝕潛力，且敏感性高，可以測(cè)得離子含量的微小變化，因此應(yīng)用十分廣泛。如，Eisenburger［14］分別使用原子吸收光譜法和鉬酸銨法測(cè)得在3 g/L檸檬酸酸蝕后，軟化脫礦的釉質(zhì)區(qū)Ca2+和磷酸根含量分別減少62%和64%。pH值和緩沖能力的測(cè)量多在研究初始階段應(yīng)用pH計(jì)和酸堿滴定法進(jìn)行，用于反映酸蝕介質(zhì)的特性，許多文章都證實(shí)軟飲料的pH大大低于釉質(zhì)溶解的臨界pH 值 5.0 ～5.5［11－13，17－19］。

但化學(xué)方法只能反映離子改變的凈效應(yīng)，是一種間接測(cè)量方法，不能模擬口腔內(nèi)牙齒酸蝕癥發(fā)生時(shí)，由于宿主生物學(xué)因素的存在而引起的牙體硬組織脫礦減少或發(fā)生再礦化的情況。

2 物理方法(Physical analysis)

2.1 輪廓測(cè)量法(Profilometry)

對(duì)牙齒硬組織包埋、開窗制成標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)處理后，使用輪廓測(cè)量儀直接測(cè)量、比較開窗區(qū)和保護(hù)區(qū)的表面形態(tài)，得到標(biāo)本表面垂直方向的喪失，從而評(píng)估酸蝕介質(zhì)的酸蝕潛力。是一種簡單快捷的評(píng)估酸蝕潛力的方法，可測(cè)量較大面積牙齒硬組織表面的酸蝕情況。Rios等［18］曾將此法用于測(cè)量不同種類可樂對(duì)釉質(zhì)造成酸蝕后，開窗區(qū)釉質(zhì)喪失的深度。

但是，該方法也存在著不少缺點(diǎn)。Ren等［20］發(fā)現(xiàn)輪廓測(cè)量儀金屬觸針的大小影響其測(cè)量精度。Heurich等［21］也發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)使釉質(zhì)表面產(chǎn)生劃痕，從而造成對(duì)酸蝕潛力的過分評(píng)估。且該方法對(duì)牙齒酸蝕癥早期軟化的釉質(zhì)表面無測(cè)量效果;標(biāo)本制備的要求較高。最近提出的激光輪廓測(cè)量法，也稱為非接觸式輪廓測(cè)量法(non－contacting surface profilometry，NCSP)，可彌補(bǔ)接觸式輪廓測(cè)量法的不足。此法用激光代替了傳統(tǒng)的觸針，通過光的干涉效應(yīng)建立起牙齒硬組織表面的“形態(tài)地圖”，不僅提供了傳統(tǒng)方法中牙齒硬組織表面垂直方向的喪失，更能體現(xiàn)其體積的喪失。直觀易懂，在釉質(zhì)表面不產(chǎn)生劃痕，激光探頭可根據(jù)標(biāo)本的大小進(jìn)行更換，使測(cè)量的標(biāo)本范圍加大。Ablal等［11］應(yīng)用此法比較了4種不同乙醇飲料的酸蝕潛力。Barbour等［12］應(yīng)用NCSP發(fā)現(xiàn):酸蝕過程中釉質(zhì)表面的喪失深度隨著酸蝕介質(zhì)溫度的升高而增加。

2.2 印壓技術(shù)(Indentation)

牙齒酸蝕癥的早期表現(xiàn)是釉質(zhì)的脫礦軟化，基于此點(diǎn)，印壓技術(shù)通過測(cè)量酸蝕前后釉質(zhì)表面硬度的改變?cè)u(píng)估牙齒酸蝕癥。包括顯微印壓技術(shù)(microindentation)和納米印壓技術(shù)(nanoindentation)。

該技術(shù)使用金剛石探頭以一定大小的負(fù)荷和速度在釉質(zhì)表面產(chǎn)生壓痕，脫礦軟化越明顯壓痕越大。實(shí)驗(yàn)對(duì)釉質(zhì)表面選3～5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，可得到釉質(zhì)表面努氏硬度(KHN)、維氏硬度(VHN)或彈性模量(Nm－2)數(shù)據(jù)。納米印壓技術(shù)能夠檢測(cè)到200 nm深度的軟化釉質(zhì)薄層，同時(shí)檢測(cè)彈性形變和塑性形變，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確。

該方法應(yīng)用廣泛，Barbour等［12］使用納米印壓技術(shù)發(fā)現(xiàn):軟飲料溫度每升高25℃，造成釉質(zhì)表面硬度降低 0.9 GPa。Rios等［18］應(yīng)用顯微印壓技術(shù)比較了不同種類可樂造成釉質(zhì)表面硬度的改變。Van Eygen等［19］使用顯微印壓技術(shù)發(fā)現(xiàn):即使短時(shí)間飲用飲料也可能降低釉質(zhì)表面硬度，飲用頻率不是表面硬度降低的決定因素。

但是，應(yīng)用該技術(shù)時(shí)，要求釉質(zhì)表面平滑且上下兩底面平行，需要對(duì)釉質(zhì)標(biāo)本表面進(jìn)行打磨，增加了標(biāo)本制備的難度，打磨還可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.3 圖像分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)

利用聚焦非常細(xì)的高能電子束在試樣上掃描，激發(fā)出各種物理信息(如二次電子、背射電子、俄歇電子等)，通過對(duì)這些信息的接受、放大和顯示成像，獲得對(duì)試樣表面形貌的觀察。實(shí)驗(yàn)方法是:制備標(biāo)本，在實(shí)驗(yàn)處理前后分別用SEM成像，就可以清晰的觀察到釉質(zhì)表面形態(tài)由規(guī)則的魚鱗狀秞柱結(jié)構(gòu)變?yōu)槎x柱或秞柱間質(zhì)礦物質(zhì)溶解形成的不規(guī)則蜂窩狀、點(diǎn)隙狀結(jié)構(gòu)，從而評(píng)估牙齒酸蝕癥。

SEM放大倍數(shù)較高，20～20萬倍之間連續(xù)可調(diào);景深及視野大，成像富有立體感，可直接觀察試樣凹凸不平表面的細(xì)微結(jié)構(gòu);重復(fù)性好。Brown等［13］將羥磷灰石經(jīng)過調(diào)味蘇打水、橙汁酸蝕后，用SEM分別觀察其表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者造成的酸蝕程度相似，糾正了將調(diào)味蘇打水作為酸性飲料代用品的錯(cuò)誤，為牙齒酸蝕癥的預(yù)防提出了新的建議。

2.3.2 原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFP)

通過檢測(cè)微懸臂一端極小的針尖與標(biāo)本之間的原子間作用力，從而獲得標(biāo)本表面的微觀形貌信息的技術(shù)。常見有接觸模式和輕敲模式兩種。

此方法可連續(xù)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)物體表面的微觀信息，獲得圖像的分辨率高，成像性能好，且不受實(shí)驗(yàn)環(huán)境(如真空、氣體和液體)和標(biāo)本的限制，應(yīng)用更加簡單方便，精確度高，可檢測(cè)到標(biāo)本表面納米數(shù)量級(jí)的改變。Heurich等［21］使用AFP為標(biāo)準(zhǔn)，分別測(cè)量輪廓測(cè)量法和激光共聚焦顯微鏡在測(cè)量酸蝕釉質(zhì)表面產(chǎn)生的劃痕深度，得出激光共聚焦顯微鏡測(cè)量酸蝕癥更加精確、快速的結(jié)論，體現(xiàn)了AFP在評(píng)估牙齒酸蝕癥中的優(yōu)勢(shì)。

原子力顯微鏡價(jià)格昂貴，每次只能檢測(cè)小于0.5 mm×0.5 mm的區(qū)域，卻需要大約60 min的工作時(shí)間。由于測(cè)量范圍過小，為使標(biāo)本的代表性增強(qiáng)，必須進(jìn)行多點(diǎn)檢測(cè)。

2.3.3 X線顯微照相技術(shù)(Microradiography)

投照于標(biāo)本的X線，在牙齒硬組織不同厚度和礦物質(zhì)含量不同的區(qū)域透過的量不同，在底片上反映出的亮度也不同，從而得到一張牙齒硬組織礦物質(zhì)含量的“地圖”。包括橫斷顯微照相技術(shù)(transverse microradiography，TMR)、縱斷顯微照相技術(shù)(longitudinal microradiography，LMR)和不依賴波長的顯微照相技術(shù)(wavelength－independent microradiography)。

雖然X線顯微照相技術(shù)主要用于齲病的研究，但也已經(jīng)被應(yīng)用于牙齒酸蝕癥的評(píng)估。其不僅能測(cè)量釉質(zhì)喪失深度，還能測(cè)量缺損下軟化釉質(zhì)礦物質(zhì)的喪失量，從而得到真正的酸蝕潛力。這也是Elton等［22］將TMR作為金標(biāo)準(zhǔn)比較定量光導(dǎo)熒光技術(shù)和NCSP評(píng)估牙齒酸蝕癥準(zhǔn)確性的依據(jù)。通過比較得出:前者用于測(cè)量軟化釉質(zhì)礦物喪失量時(shí)準(zhǔn)確性較高，而NCSP用于測(cè)量釉質(zhì)喪失深度時(shí)準(zhǔn)確性較高。Ablal等［11］應(yīng)用 TMR等測(cè)量技術(shù)發(fā)現(xiàn):暴露于4種乙醇飲料不同時(shí)間后，牛牙釉質(zhì)標(biāo)本均有喪失，喪失程度與飲料的pH值和酸蝕時(shí)間直接相關(guān)。

2.3.4 定量光導(dǎo)熒光技術(shù)(Quantitative light－induced fluorescence，QLF)

離體牙標(biāo)本酸蝕前后，用微型攝像機(jī)攝取圖像，分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，得出脫礦釉質(zhì)的熒光喪失量與正常釉質(zhì)熒光量的百分比△Q，即△Q=(Fsound－Ferosion)/Fsound×100%，計(jì)算得到酸蝕后釉質(zhì)脫礦的多少，從而比較不同酸蝕介質(zhì)酸蝕潛力的方法。

該方法無需制備標(biāo)本，是一種很有潛力的實(shí)驗(yàn)室可廣泛應(yīng)用的技術(shù)手段。將其應(yīng)用于評(píng)估牙齒酸蝕癥也得到了滿意效果。Ablal等［11］使用此法得到牛牙釉質(zhì)標(biāo)本隨4種乙醇飲料酸蝕時(shí)間的延長△Q增加，脫礦量增加。而且，QLF是目前唯一可用于臨床診斷牙齒酸蝕癥的方法:壓縮空氣吹干牙面后，使用口內(nèi)攝像頭，得到酸蝕牙齒的熒光圖像，與參考牙齒的熒光圖像進(jìn)行比較，使用軟件對(duì)酸蝕后釉質(zhì)的脫礦程度進(jìn)行計(jì)算和評(píng)分。

但是，QLF僅能測(cè)得釉質(zhì)脫礦量的改變，對(duì)于釉質(zhì)的喪失深度無測(cè)量效果。故僅用于測(cè)量尚無實(shí)質(zhì)缺損的或存在于實(shí)質(zhì)缺損下的軟化釉質(zhì)脫礦量的改變。這一點(diǎn)在Elton等［22］的研究中有所闡述。

此外，也有學(xué)者提出了一些評(píng)估牙齒酸蝕癥的其他方法，如次級(jí)離子質(zhì)譜分析法(Secondary ion mass spectroscopy，SIMS)，可變焦距3D掃描顯微鏡法［20］，激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)［21］等，其中多種方法有很大的應(yīng)用潛力，值得比較分析。

3 總結(jié)

本文主要討論了幾種廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估牙齒酸蝕癥的技術(shù)。輪廓測(cè)量法和顯微照相技術(shù)主要用于測(cè)量進(jìn)展期牙齒酸蝕癥已造成牙齒硬組織喪失時(shí)，而對(duì)于早期牙齒酸蝕癥的評(píng)估，主要采用更加敏感的技術(shù)，如印壓技術(shù)，尤其是納米印壓技術(shù)?；瘜W(xué)方法可測(cè)量不同階段的牙齒酸蝕癥，但是其只是一種間接測(cè)量方法。掃描電子顯微鏡常作為其他技術(shù)，如印壓技術(shù)等，無法直接觀察牙齒硬組織表面形態(tài)改變時(shí)的補(bǔ)充手段，僅能得到定性測(cè)量的結(jié)果。而原子力顯微鏡擁有定量測(cè)量和定性觀察表面形態(tài)的雙重作用，故應(yīng)用前景更加廣泛。而作為唯一一種能夠同時(shí)應(yīng)用于臨床測(cè)量牙齒酸蝕癥的定量光導(dǎo)熒光技術(shù)，可能會(huì)得到更多學(xué)者的青睞。

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