大黃素對白血病K562細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡體外研究近況

孟 晉

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 300193

白血?。╨eukemia）是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是最常見的血液系統(tǒng)惡性疾病。我國白血病的發(fā)病率約為2.76/10萬，且近年有上升的趨勢。在惡性腫瘤所致的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），但在兒童和35歲成人中則居第1位。隨著新的化療藥物的出現(xiàn)和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷提高，白血病患者的治療療效和生存率有了很大的提高。但是仍有30%左右的患者經(jīng)過治療后不能緩解或者緩解后再復(fù)發(fā)。造成治療失敗的主要原因是治療過程中出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥（drug resistance），特別是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR），導(dǎo)致化療失敗。因此積極尋找新的有效、低毒的化療藥物和化療方案已經(jīng)成為血液學(xué)工作者的重要任務(wù)之一。大黃（Rhubarb）為中醫(yī)臨床常用中藥，具有瀉下攻積、涼血解毒、清熱利濕等作用?，F(xiàn)代藥理研究及臨床應(yīng)用表明，大黃具有良好的抗病毒、止血、健胃、利膽、瀉下、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、利尿、降脂、降壓、抗腫瘤及改善腎功能等多種作用。其有效成分之一的大黃素（Emodin，EM）是一種蒽醌類化合物，具有廣泛的作用，如抗腫瘤、抗菌、抗老化及促進(jìn)胃腸平滑肌運(yùn)動［1～5］。

1 大黃素對血液系統(tǒng)腫瘤的影響

Kawai等首先發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制鼠白血病L1210細(xì)胞的生長，隨后發(fā)現(xiàn)大黃素對多種腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用［6］。人類紅白血病細(xì)胞系K562是由Lozzio等于1975年從1例處于原始細(xì)胞危象的慢性髓系白血病患者的胸腔滲出液中建立的，因其具有費城染色體（Ph）及bcr/abl融合基因，常被用于CML的體外研究?，F(xiàn)代研究證明很多中藥有不同程度抗腫瘤作用，中藥以其攻補(bǔ)兼施，毒副反應(yīng)小或無，注意整體的優(yōu)越性而在腫瘤治療中得到廣泛認(rèn)可或重視［7］。Mcgahon等［8］研究發(fā)現(xiàn)，K562細(xì)胞對多種化療藥物誘導(dǎo)的凋亡有很強(qiáng)的抵抗性，這種抗凋亡的機(jī)制可能與CML特征性bcr/abl融合基因所表達(dá)的P210bcr/abl融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶（TK）活性有關(guān)［9］。有研究證明，大黃素對小鼠P338白血病有抑制作用。黃綠葉等［10］的實驗證實，大黃素能有效抑制HL60細(xì)胞增殖，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)其凋亡。連曉嵐等［11］研究發(fā)現(xiàn)大黃素能抑制U937細(xì)胞增殖。大黃素作用后克隆形成率下降，出現(xiàn)亞二倍體峰及DNA片段化，細(xì)胞阻滯在 G0/G1期；bcl－2/bax的比值降低；CPP32活化，這些可能參與了大黃素抑制U937細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的過程。

2 近年來的實驗研究

2.1 大黃素對于K562細(xì)胞基因表達(dá)的影響 張叢叢［12］通過流式細(xì)胞儀檢測，酶標(biāo)儀檢測caspase3/7活性，RT－PCR檢測bcl－2、NF－κB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大黃素能抑制K562細(xì)胞生長并具有濃度依賴性，對K562細(xì)胞的IC50為51.58μmol/L，大黃素處理后，K562細(xì)胞主要表現(xiàn)為S期細(xì)胞增多、G0/G1期及G2/M 期細(xì)胞減少（P＜0.05）；U937細(xì)胞主要表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞增多、G2/M期及S期細(xì)胞減少（P＜0.05）。兩種細(xì)胞的凋亡率也隨濃度的增加而增加（P＜0.05）。大黃素處理后 K562細(xì)胞內(nèi)的caspase3/7酶活性增加，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)過大黃素處理后K562細(xì)胞內(nèi)的bcl－2、NF－κB的表達(dá)均較對照組下調(diào)。

胡建達(dá)［13］等應(yīng)用 MTT、DNA片段化分析及TdT酶介導(dǎo)的末端缺失原位標(biāo)記法檢測大黃素對K562細(xì)胞增殖及凋亡的影響；RT－PCR檢測大黃素對K562細(xì)胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA表達(dá)的影響，免疫印跡實驗法檢測大黃素對K562細(xì)胞bcr/abl融合蛋白P210表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素能有效抑制K562細(xì)胞的增殖作用72h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為20μmol/L并能誘導(dǎo)其凋亡，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也逐漸上升，大黃素下調(diào)K562細(xì)胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA 的表達(dá)，也下調(diào)了K562細(xì)胞P210蛋白的表達(dá)。

2.2 大黃素對于K562細(xì)胞生長周期的影響 鄭志宏［14］等通過采用MTT法、集落形成試驗觀察大黃素對K562增殖的影響、Annexin VFITC/PI法、DNA倍體分析及DNA凝膠電泳法檢測細(xì)胞凋亡，Westernblot檢測大黃素作用后不同時間段P210、磷酸化P210、caspase23前體蛋白及PARP表達(dá)水平的變化發(fā)現(xiàn)，大黃素作用K562細(xì)胞后，隨大黃素濃度增大，細(xì)胞增殖抑制越明顯，呈劑量依賴性；隨時間的延長，大黃素對K562細(xì)胞的抑制率也逐漸升高，呈時間依賴性。大黃素處理K562細(xì)胞48h半數(shù)抑制濃度（IC50）為38.25μmol/L。大黃素作用K562細(xì)胞24h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率主要以早期凋亡為主，并逐漸增加。大黃素作用48h后即可見亞二倍體G1峰（凋亡峰）的出現(xiàn)，凋亡率為9.12%；隨藥物濃度的增大，凋亡率升高，40及80μmol/L大黃素作用的凋亡率分別為25.33%及34.92%。

張旭霞［15］等采用MTT法測定細(xì)胞的增殖抑制率，實驗組、對照組和藥物試驗組應(yīng)用熒光染色法觀察不同濃度大黃素作用后細(xì)胞形態(tài)的改變判定凋亡效果，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷程度，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，RT－PCR法檢測大黃素作用前、后c－myc mRNA表達(dá)水平的變化發(fā)現(xiàn)大黃素對K562細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并呈濃度和時間依賴性（P＜0.01），其96h半數(shù)抑制濃度（IC50）約為53.28μmol/L。大黃素作用96h后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核不規(guī)則，核碎裂呈新月形改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，基因組DNA顯現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的梯狀圖譜。流式細(xì)胞儀檢測可見大黃素影響細(xì)胞周期，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。RT－PCR法檢測顯示c－myc基因表達(dá)減弱（P＜0.01），100μmol/L大黃素作用后表達(dá)強(qiáng)度較對照組減少54%。并認(rèn)為大黃素能有效抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能是使細(xì)胞受阻于G0/G1期而進(jìn)入凋亡程序，c2myc表達(dá)降低可能是大黃素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡重要途徑之一。

金丹婷［16］等通過 MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase檢測等方法觀察大黃素對K562細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用發(fā)現(xiàn)大黃素能顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，作用24、48、72h后的半數(shù)抑制率濃度分別為80、50、40μmol/L；處理組細(xì)胞在普通光鏡下可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測到K562細(xì)胞在大黃素的誘導(dǎo)下出現(xiàn)早期凋亡并呈劑量依賴性（P＜0.01）；流式細(xì)胞儀結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，處理組的K562細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，與對照組相比，凋亡率明顯升高并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.01）；大黃素可觸發(fā)Caspase－3、8、9的活性增高（P＜0.01）。

2.3 大黃素對K562細(xì)胞蛋白合成的影響 鄭志宏［17］應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測大黃素對K562/Adr細(xì)胞增殖的影響；DNA片段化分析、AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡檢測、DNA倍體分析及TdT酶介導(dǎo)的末端缺失原位標(biāo)記（TUNEL）法檢測大黃素對K562/Adr細(xì)胞凋亡的影響；RT－PCR法檢測大黃素作用前后 K562/Adr細(xì)胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 表達(dá)的影響；Western blotting法檢測大黃素對K562/Adr細(xì)胞c－myc蛋白、bcr/abl融合蛋白P210表達(dá)的影響及大黃素作用后HL－60、K562/Adr細(xì)胞Akt信號通路蛋白表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)：（1）大黃素能有效抑制K562/Adr細(xì)胞的增殖，作用72h的IC50約為20μmol/L，并能誘導(dǎo)其凋亡，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也漸上升。（2）大黃素下調(diào) K562/Adr細(xì)胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 的表達(dá)；也下調(diào)了 K562/Adr細(xì)胞c－myc、P210蛋白的表達(dá)。（3）大黃素下調(diào)HL－60、K562/Adr細(xì)胞 Akt信號通路蛋白 Akt、p－Akt、IκB－α、p－IκB－α、p65、p－p65、mTOR、p－mTOR的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)：（1）大黃素能有效抑制K562/Adr細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；并可能通過下調(diào)c－myc、bcr/abl和mdr－1的表達(dá)起作用。（2）Akt信號通路參與了大黃素抑制HL－60、K562/Adr細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的過程。

3 結(jié)語

許多研究已證實大黃素具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抑制胰酶作用、抗氧化及清除氧自由基、抗炎抑菌及免疫調(diào)節(jié)作用、肝腎保護(hù)作用及抗腫瘤作用等。特別是大黃素具有的抗腫瘤活性使它備受關(guān)注，它的抗腫瘤機(jī)制也成為研究的熱點。許多對化療藥已不敏感的腫瘤細(xì)胞對大黃素還存在一定的敏感度，這就為以后的抗腫瘤治療提供了新的前景，但仍有待進(jìn)一步深入研究，如體外研究多，體內(nèi)研究少；誘導(dǎo)凋亡、分化的研究大部分停留在對現(xiàn)象的觀察及個別指標(biāo)的檢測上；逆轉(zhuǎn)MDR的研究作用靶點較單一，要與現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)結(jié)合起來進(jìn)一步探明其作用機(jī)制和靶點。如何從多層次、多學(xué)科對其抗腫瘤作用機(jī)理進(jìn)行具體化、客觀化、定性定量的研究，以進(jìn)一步揭示其奧秘，尚有待醫(yī)學(xué)科研工作者不斷努力。

［1］王丹丹，李維.大黃素對小鼠變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎的抑制作用〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，26（1）：14－15.

［2］Srinivas G，Anto RJ，Srinivas P，et al.Emodin induces apop tosis ofhuman cervical cancer cells through poly（ADP－ribose）polymerase cleavage and activation of caspase－9〔J〕.Eur J Pharmacol，2003，473（223）：117－125.

［3］Su YT，Chang HL，Shyue SK，et al.Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species－dependent mitochondrial signaling pathway〔J〕.Biochem Pharmacol，2005，70（2）：229－241.

［4］和付林，王力，張曉坤，等.大黃素誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制視黃醇X受體的轉(zhuǎn)錄激活功能〔J〕.藥學(xué)學(xué)報，2008，43（4）：350－355.

［5］Yu CX，Zhang XQ，Kang LD，et al.Emodin induces apoptosis in human prostate cancer cell LNCap〔J〕.亞洲男性學(xué)雜志：英文版，2008，10（4）：625－634.

［6］廖子君，宋永春，陳曉泉，等.大黃素對人肺腺癌A－549細(xì)胞增殖周期影響的實驗研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2007，17（5）：342－344.

［7］李海燕.中醫(yī)藥治療急性白血病進(jìn)展〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17（1）：58.

［8］Mcgahon A，Bissonnette R，Schmitt M，et al.BCR/ABL maintains resistance of chronic myelogenous leukemia cells to apoptotic cell death〔J〕.Blood，1994，83（5）：1179－1187.

［9］Wang JY.Regulation of cell death by the Abl tyrosine kinase〔J〕.Oncogene，2000，19（49）：5643－5650.

［10］鄭合勇，胡建達(dá)，黃綠葉，等.大黃素可能通過抑制Akt信號通路誘導(dǎo) HL－60細(xì)胞凋亡〔J〕.藥學(xué)學(xué)報，2007，42（11）：1142－1146.

［11］連曉嵐，胡建達(dá)，鄭志宏，等.大黃素誘導(dǎo)白血病U937細(xì)胞凋亡及機(jī)制初探〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2007，23（10）：1312－1316.

［12］張叢叢.大黃素對白血病細(xì)胞株K562和U937細(xì)胞的增殖抑制及機(jī)制初探〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2009.

［13］鄭合勇，鄭志宏，陳英玉，等.大黃素誘導(dǎo)耐藥白血病細(xì)胞株K562/Adr凋亡及下調(diào)P210表達(dá)的影響〔J〕.中國實用內(nèi)科學(xué)雜志，2007，（S1）：23.

［14］鄭志宏，胡建達(dá)，等.大黃素對K562細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用〔J〕.中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17（6）：1434－1438.

［15］張旭霞，孫延慶，等.大黃素對人慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞增殖與凋亡及c2myc基因表達(dá)的影響〔J〕.中華腫瘤防治雜，2009，16（20）：1541－1545.

［16］金丹婷，劉北忠，等.大黃素誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡的實驗研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，34（7）：822－825.

［17］鄭合勇.大黃素通過抑制Akt信號通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL－60、K562/Adr細(xì)胞凋亡〔D〕.福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2000.