鴨肝炎病毒研究進(jìn)展

陽佑天綜述 郭霄峰 魏平華審閱（ 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣州 5064 廣州格雷特生物科技有限公司 廣州 50730）

鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)是雛鴨的鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis,DVH)的病原。該病特點為發(fā)病急、病程短、傳播快和病死率高，臨床表現(xiàn)為角弓反張,剖檢見肝腫大和大量出血性斑點。鴨肝炎病毒有3個不同的血清型，即血清Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，它們之間無交叉中和反應(yīng)和交叉保護(hù)作用[1]。鴨肝炎病毒常與其他病毒、細(xì)菌混合感染，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。

1 歷史與分布

1945年，Levine和Hofstad首先發(fā)現(xiàn)Ⅰ型鴨病毒性肝炎，但沒有分離到病原。1949年春，Levine和Fabricant對發(fā)生在紐約長島的白色北京鴨雛的一種高度致死性疾病進(jìn)行了研究，1950年用雞胚分離到病毒[2]。此后在英國、加拿大、德國、意大利、印度、法國、蘇聯(lián)、匈牙利和日本等國陸續(xù)報道了該病的流行。Ⅰ型病毒性肝炎呈世界性分布，我國南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和北京農(nóng)業(yè)大學(xué)通過病毒中和試驗和血清被動保護(hù)試驗，證實我國流行的鴨肝炎病毒屬I型[3]。

1965年在英格蘭的諾?？耍∟orfolk）首次報道了雛鴨暴發(fā)Ⅱ型病毒性肝炎。發(fā)病鴨群已免疫過Ⅰ型DHV弱毒，雛鴨交叉免疫保護(hù)實驗表明，此次暴發(fā)的病原與Ⅰ型鴨肝炎病毒不同，命名為Ⅱ型鴨肝炎病毒。該病原引起的DVH僅在英格蘭East Anglia地區(qū)有報道，而且自1980年代中期暴發(fā)后，該地區(qū)也未見有本病發(fā)生。

Ⅲ型鴨肝炎病毒由Toth首次在紐約長島報道。目前只知道美國發(fā)生過這種由Ⅲ型鴨肝炎病毒引起的DVH[2]。

2 病原特征

Ⅰ型鴨肝炎病毒最初屬微RNA病毒科腸病毒屬成員。后來，研究發(fā)現(xiàn)DHV與小RNA病毒科9個已知屬23種病毒之間的衣殼蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%，故它們應(yīng)屬于小RNA病毒科的一個新屬，ICTV小RNA病毒研究組建議稱之為禽肝病毒屬(Avihepatpvirus)[4]。該病毒大小為20～40nm，無囊膜，基因組為單分子線狀正鏈RNA，含有VP1、VP2和VP33種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1區(qū)存在多個免疫優(yōu)勢輔助性T細(xì)胞抗原位點及其抗原決定簇，構(gòu)成主要的T、B淋巴細(xì)胞抗原表位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且與病毒基因型和血清型的多樣性有關(guān)[5]。因此VP1常作為病毒遺傳變異分析的參考依據(jù)。N-DHV具有與DHV-Ⅰ相似的分子結(jié)構(gòu),但其基因組比DHV-Ⅰ稍大[6]。病毒對乙醚、氯仿、胰蛋白酶及常用消毒劑等有一定的抵抗力，能耐受pH 3.0的酸性環(huán)境，具有一定的熱穩(wěn)定性。DHV-Ⅰ不能凝集任何動物或人的紅細(xì)胞,病毒可在鴨胚、雞胚和鵝胚的絨毛尿囊腔內(nèi)增殖[1,3]。在DHV-Ⅰ細(xì)胞培養(yǎng)方面，1996年，羅函祿[7]首次在國內(nèi)使DHV適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的培養(yǎng)。已有的研究結(jié)果表明，鴨胚肝細(xì)胞、鴨胚腎細(xì)胞和鵝胚腎細(xì)胞等均能支持該病毒的生長[8]。但犢牛血清對DHV增殖具有明顯的抑制作用,因此，僅有少數(shù)報道描述了該病毒的細(xì)胞培養(yǎng)[9]。

Ⅱ型鴨肝炎病毒屬于星狀病毒科星狀病毒屬，暫命名為鴨星狀病毒。該病毒呈球形，因在電鏡下呈現(xiàn)特征性的帶有頂角的星形，而得此名。直徑為27～30nm,基因組為單分子線狀正鏈RNA。病毒可耐受氯仿、pH3、胰酶處理和50℃加熱1h。甲醛熏蒸消毒和標(biāo)準(zhǔn)的消毒措施可消滅污染圈舍中的病毒[1,2]。

Ⅲ型鴨肝炎病毒分類同Ⅰ型鴨肝炎病毒，其形態(tài)、大小、核酸及理化特性與Ⅰ型相似。病毒可耐受氯仿、pH3，但對50℃加熱敏感。

3 病原的變異性

1992年，Sandhu報道了Ⅰ型鴨肝炎病毒的變異株DHV-Ⅰa，并通過雞胚交叉中和反應(yīng)證實DHV-Ⅰa和典型的DHV-Ⅰ存在部分交叉反應(yīng)[10]。Woolcock通過鴨胚腎細(xì)胞空斑減數(shù)試驗證明這2個病毒有所不同[11]。在國內(nèi)，林世棠[12]首先報道Ⅰ型DHV的變異株，其試驗結(jié)果與Sandhu相符。隨后，中國臺灣Tseng[13]和韓國Kim[14]陸續(xù)分離出了與典型的DHV-Ⅰ基因組結(jié)構(gòu)相近的DHV,稱“臺灣新型”和“韓國新型”,兩種新型之間的血清學(xué)關(guān)系尚不清楚,但均不與DHV-Ⅰ產(chǎn)生交叉中和反應(yīng)。2010年，何冉婭[5]對2007～2009年華南地區(qū)鴨肝炎病毒進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及變異分析,結(jié)果表明華南地區(qū)DHV已發(fā)生變異,且存在兩種基因型毒株的流行。2011年，Liu[15]報道了中國第一例從鵝中分離到DHV-ⅠJT株病毒，可用抗DHV-Ⅰ的單克隆抗體檢測陽性細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)中的病毒抗原。用病毒序列特異性引物PCR擴(kuò)增，完整的序列表明從鵝分離的JT株與韓國DHV-ⅠC AP-03337株顯示了95.9%的同源性，而與經(jīng)典的DHV-Ⅰ病毒僅為75.3%。80%雛鵝被JT株感染后均發(fā)展為出血性肝炎。張大丙主張將DHV分為血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”,分別對應(yīng)基因A型、B型和C型,對于新的血清型統(tǒng)稱為N-DHV[16]。為了進(jìn)一步避免典型DHV-I及其變異株和DHV-II，III的混淆,引入了一個新的病毒種名,即將血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”歸為鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)[17]。

2006年，KIM[18]對DHA-Ⅰ全基因組進(jìn)行了測序，證明DHA-Ⅰ有小RNA病毒的基因組基本結(jié)構(gòu),即僅含一個大的ORF,其兩側(cè)分別是5'UTR和3'UTR，3'UTR之后是poly(A)尾。ORF編碼一個聚蛋白,從N端到C端方向,分別為結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P1)和兩個非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(P2和P3)。預(yù)測P1區(qū)裂解為3種衣殼蛋白 (VP0、VP3和VP1),P2區(qū)裂解為4種或5種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A1、2A2或2A2+2A3、2B和2C),P3區(qū)裂解為4種非結(jié)構(gòu)蛋白(3A、3B、3C和3D)。Wang[19]對2001～2007年得到中國分離株血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”3種不同血清型的DHV的VP1、VP0、VP3蛋白全部核苷酸序列和3D蛋白的部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。發(fā)現(xiàn)基于VP1蛋白序列與基于其他3個蛋白序列的基因分群結(jié)果非常一致。因此，建議將3個基因群分為DHV A、B和C型。所有典型DHV-Ⅰ株稱為基因型A，分離于“臺灣新型”和“韓國新型”DHV株分別稱為基因型B和C。Jin X[20]對分離于中國湖北省的DHV-ⅠJX高致病株進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)JX株與其他DHV-Ⅰ株有94%～99%的氨基酸水平95%～99%的核苷酸相似性。結(jié)果顯示，核苷酸和氨基酸的突變主要分布在VP1基因的序列，暗示VP1很可能是DHV-Ⅰ毒力的主要決定因素。同年，Liu[21]對9個中國東南區(qū)的DHV分離株和3個DHV-Ⅰ弱毒疫苗株的VP1基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)分離株和所有疫苗株之間有2個氨基酸的一致替換；羧基末端區(qū)通常有最大的變量，在這里分離株和所有疫苗株之間發(fā)現(xiàn)6個一致差異，結(jié)果表明中國東南部分離鴨肝炎病毒Ⅰ型（DHV-Ⅰ）的VP1基因的遺傳多樣性與分離株制弱有關(guān)。王麗艷[22]擴(kuò)增并測定15株DHV的衣殼蛋白編碼區(qū)序列和部分3D序列。結(jié)果表明，在同一個基因型內(nèi)，衣殼蛋白序列高度保守;在不同的基因型間，衣殼蛋白序列高度變異。但在3D氨基酸水平，型內(nèi)序列高度保守，型間序列亦較為保守。并基于此，初步制定這樣的基因分型標(biāo)準(zhǔn):型內(nèi)VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分別應(yīng)大于或等于90%和92%、92%和96%、91%和95%，型間VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分別不超過72%和79%、73%和81%、74%和83%。部分3D核苷酸序列也可用于DHV的基因分型，型內(nèi)相似性應(yīng)大于或等于91%，型間相似性不超過82%。

4 鴨肝炎病毒檢測方法

4.1 血清學(xué)診斷

血清學(xué)方法是目前檢測DHV的主要方法，包括中和試驗、間接血凝試驗、SPA協(xié)同凝集試驗、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(AGDP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光抗體技術(shù)和空斑減少試驗等。

4.1.1 中和試驗

中和試驗，分為鴨胚、雞胚或病毒適應(yīng)細(xì)胞中和試驗。1950，Levine[23]首次報道該方法應(yīng)用于DHVI的診斷。1969年，Hwang[24]改進(jìn)待檢血清和病毒反應(yīng)的溫度，研究表明DHV-I雞胚中和試驗準(zhǔn)確、重復(fù)性好。1997年，陳琨[25]用鴨病毒性肝炎病毒及其陽性血清在鴨胚肝細(xì)胞單層上進(jìn)行微量血清中和試驗，結(jié)果表明，其敏感性高于鴨胚中和試驗。目前中和試驗仍然是公認(rèn)的權(quán)威方法,但其操作繁瑣、費時,不適于快速診斷，不能進(jìn)行基層推廣。

4.1.2 間接血凝試驗

間接血凝試驗，即以紅細(xì)胞作可溶性抗原的載體來檢測抗體。1996年，孫泉云等[26]粗提DHV經(jīng)SephadexG200柱層析純化后作為致敏用抗原，戊二醛法固定綿羊紅細(xì)胞、BDB法致敏抗原紅細(xì)胞，建立了檢測DHV抗體的間接血凝試臉，然而由于非特異性凝血因子的影響，以及不同批次制備的紅細(xì)胞在敏感性和穩(wěn)定性方面有波動，限制了該方法的推廣應(yīng)用。

4.1.3 SPA 協(xié)同凝集試驗

1996年，汪銘書等[27]應(yīng)用葡萄球菌A蛋白作協(xié)同凝集試驗，快速檢測出了鴨肝炎病毒，對DHV攻擊死亡的雛鴨肝臟的檢出率為100%。結(jié)果表明SPA-CoA用于檢測DHV的含毒材料，具有較好的敏感性和特異性，適用于臨床及基層推廣。

4.1.4 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(AGDP)

1961年，Murty等[28]首次報道采用瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗診斷DHV。1997年，許偉琦等[29]將2%PEG加入到瓊擴(kuò)試驗中，能大大加快沉淀反應(yīng)，而且提高了沉淀線清晰度。2002年，張濟(jì)培等[30]用氯仿去脂和反透析法進(jìn)行病毒的提純濃縮,研究鴨肝炎的瓊脂擴(kuò)散試驗。并發(fā)現(xiàn)瓊脂凝膠配制的最佳方案是pH7.2,NaCl為80 g/L和瓊脂糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。瓊脂擴(kuò)散試驗易產(chǎn)生抗原不純的現(xiàn)象,且檢測靈敏度不高。

4.1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前常用的一種簡便、快速、敏感的診斷檢測方法之一。包括競爭ELISA法、間接ELISA法和雙抗體夾心ELISA法等。1990年,趙新柳等[31]最先建立ELISA法檢測鴨病毒性肝炎(DVH)抗體，并與瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(AGDP)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明ELISA的特異性與AGDP相一致;而在敏感性方面，ELISA的檢出率為100%，而AGDP為60%。隨著DHV單克隆抗體的研制成功，1992年，陳溥言等[32]建立了夾心ELISA檢測方法，對蔗糖密度梯度離心和柱層析提純病毒的檢測，效果較好。1991年，范偉興等[33]建立Dot-ELISA法，用抗DHV單克隆抗體檢測DHV抗原，并獲成功。除此之外，一些新興的ELISA檢測方法也相繼報道[26,34-40]。ELISA法有簡便、快速及特異性強(qiáng)等優(yōu)點，但抗原純度要求較高，陰性血清制備存在難度及單克隆抗體尚未商品化供應(yīng)，推廣受到一定限制。目前國內(nèi)已有ELISA試劑盒申請專利。

4.1.6 熒光抗體技術(shù)

1972年，Maiborda[41]報道熒光抗體技術(shù)是檢測接種雛鴨DHV最快速準(zhǔn)確的診斷方法。1984年，郭玉璞等[42]運用該方法證實了北京地區(qū)流行的DHV由I型DHV引起。免疫熒光抗體法雖然具有快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點，但其費用較高，對設(shè)備的要求也很高，因此在基層推廣應(yīng)用該方法不太現(xiàn)實。

4.1.7 空斑減少試驗

Woolcock等[43]首先建立了空斑減少試驗檢測DHV中和抗體，報道這一方法比雞胚中和試驗敏感。

4.2 分子生物學(xué)診斷

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，以及對DHV基因組研究的不斷深入，分子生物學(xué)檢測DHV有多種方法。主要包括RT-PCR方法、巢式RT-PCR和SYBR GreenI熒光定量RT-PCR方法等。

4.2.1 RT-PCR

2007年，馬秀麗等[44]根據(jù)Genebank中I型鴨病毒性肝炎病毒的基因序列,設(shè)計引物對DHV分離株采用RT-PCR，最低RNA模板檢出量為100pg,成功建立DHV-I的RT-PCR方法，結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。同年，程安春等[45]建立了檢測DHV-I的RT-PCR方法，敏感性達(dá)到30 pg，且證明RT-PCR方法比病毒分離和Dot-ELISA具有更高的敏感性。羅玉均等[46]通過目前已發(fā)表的DHV-I基因組序列相對保守的區(qū)域，設(shè)計引物，成功建立了RT-PCR方法檢測鴨肝炎病毒Ⅰ型。王非等[47]根據(jù)GeneBank中Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒的基因序列，設(shè)計引物對DHV-ⅠZJ-V株采用RT-PCR，結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。2008年，高駿[48]、張祥斌[49]、劉艷萍[50]分別對 DHV-I分離株（S1、S2）、福建 DHV 分離株(DH1～DH6)以及河北、北京和天津 DHV 分離株(HB3、BJ5、TJ1)采用 RT-PCR，結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。隨后，2009年邵澤香[51]、黨龍[52]、何冉婭[53]，2010 年魏雪濤[54]對RT-PCR條件優(yōu)化，成功建立了Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的鑒別RT-PCR檢測方法。

4.2.2 新型 RT-PCR 方法

2008年，黃顯明[55]建立了適合DHV-I快速檢測的RT-nested-PCR,第1次擴(kuò)增的敏感性是100 pg,第2次擴(kuò)增的敏感性是1 fg,第2次比第1次擴(kuò)增的敏感性高105倍。同年，羅玉均等[56]建立了巢式PCR與SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法，結(jié)果表明巢式PCR敏感性為6 pg/mL，實時熒光定量RT-PCR確定特異性產(chǎn)物的Tm值為85.6℃,最低能檢測到含0.015 fg/μL陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，顯示了較好的特異性、敏感性。關(guān)育芳[57]、Yang M[58]先后成功地建立了一步法RT-PCR檢測方法。該方法靈敏度高，且一步法的操作，既方便又減少污染的機(jī)會，具備了特異、快速和敏感的特點，更加適合于臨床大量樣品的檢測。2011年，孫濤等[59]用RT-PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC),建立I型鴨肝炎病毒的快速檢測方法。PCR-DHPLC與熒光RT-PCR檢測方法相比較,兩種方法檢測DHV-I的符合率為100%。李嬌等[60]對DHV-I的逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，該方法第1次擴(kuò)增的敏感性為100pg，第2次擴(kuò)增的敏感性達(dá)到1pg，敏感性提高了100倍，表明該方法具有良好的敏感性，是一種有效的新方法。

4.2.3 RT-LAMP

反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 (RT-LAMP)是最早由Notomi等[61]報道的一種新型核酸擴(kuò)增與檢測方法。即采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件(60～65℃)下，不到1 h的時間里進(jìn)行核酸擴(kuò)增,其擴(kuò)增效率可達(dá)到 109～1010個數(shù)量級[62]。2012 年，Song 等[63]建立了快速檢測Ⅰ型鴨肝炎病毒的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)快速檢測法，研究結(jié)果表明該方法與RT-PCR相比，具有更為快速、靈敏及可視化的優(yōu)點。

5 結(jié)語

鴨病毒性肝炎的流行給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加快對鴨肝炎病毒的病原學(xué)、變異性、分子生物學(xué)和功能基因組研究進(jìn)程，找出一種快速、靈敏及特異性的檢測方法，對控制該病的傳播和流行極為重要。目前，將基因工程技術(shù)運用到檢測方法中,使DHV的檢測更具特異性和敏感性,必將具有良好的應(yīng)用前景。現(xiàn)在雖然市場上已有較好的DHV弱毒疫苗和滅活疫苗,但是從安全性、高效性等方面來考慮,利用高科技的基因工程技術(shù),研發(fā)和推廣基因工程疫苗將在DHV的防控起到至關(guān)重要的作用。

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