陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率影響因素的研究進(jìn)展

黃柯鑫 綜 述 趙 斌 審 校

廣東醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)，廣東省湛江市 524000

20世紀(jì)80年代，F(xiàn)elgner等首次通過實(shí)驗(yàn)證明了陽離子脂質(zhì)體可用于DNA轉(zhuǎn)染。近年來，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用都已取得了很大的進(jìn)展。陽離子脂質(zhì)體安全性好、操作簡單，被廣泛用于DNA、RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。陽離子脂質(zhì)體在基因轉(zhuǎn)染的成功運(yùn)用，為基因轉(zhuǎn)移開辟了一條新途徑，并顯示出廣闊的前景。然而，陽離子脂質(zhì)體參與體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染的過程中，受到諸多因素的影響，現(xiàn)就其進(jìn)展綜述如下。

1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染主要通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其機(jī)制可簡述為：帶正電的陽離子脂質(zhì)體通過靜電作用與帶負(fù)電的基因（DNA或RNA）形成脂質(zhì)－基因復(fù)合物（lipoplexes，簡稱脂質(zhì)復(fù)合物），陽離子脂質(zhì)體表面過剩的正電荷通過靜電作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)胞膜上［1］，而脂質(zhì)體本身具有的親脂性，使脂質(zhì)復(fù)合物通過細(xì)胞內(nèi)吞或細(xì)胞膜融合作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)涵體；脂質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中或進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞核內(nèi)釋放基因，從而在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。

2 影響陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的因素

2.1 陽離子脂質(zhì)體的構(gòu)型 深入探究陽離子脂質(zhì)體的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)提高其轉(zhuǎn)染效率有著重要的意義［2］。陽離子脂質(zhì)體通常由一個(gè)陽離子兩性化合物即細(xì)胞轉(zhuǎn)染素（cytofectin）和一個(gè)中性（或兼性）輔助磷脂組成。常用的輔助磷脂有二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1，2二油酸甘油3磷脂酰膽堿（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇（Chol）、磷脂酰膽堿（PC）等。細(xì)胞轉(zhuǎn)染素與輔助磷脂結(jié)合能形成穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu)，降低陽離子頭部的毒性作用，同時(shí)為陽性脂質(zhì)提供細(xì)胞滲透功能，因此，中性輔助脂成分可增強(qiáng)陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活力［3］。其中，中性磷脂DOPE的細(xì)胞膜去穩(wěn)定化作用，能直接誘導(dǎo)脂質(zhì)體膜與內(nèi)涵體膜融合，從而使DNA迅速釋放。研究發(fā)現(xiàn)，陽離子脂質(zhì)單體有錐形、非反轉(zhuǎn)六角形（HⅠphase）和反轉(zhuǎn)六角形（HⅡphase）等不同空間構(gòu)型，當(dāng)膜融合作用占優(yōu)勢時(shí) HⅡphase的結(jié)構(gòu)形式最利于轉(zhuǎn)染［4］。

2.2 陽離子脂質(zhì)體的制備 除了陽離子脂質(zhì)體本身的構(gòu)型特點(diǎn)外，脂質(zhì)體的制備差異，對(duì)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性也起到重要的影響，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中，陽離子脂質(zhì)體從溶酶體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的速率，對(duì)轉(zhuǎn)染效果有著直接的影響。在陽離子脂質(zhì)和中性輔助磷脂這兩種成分的基礎(chǔ)上，添加其他的輔助材料，也可提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Shigeta等［5］合成了新型的組氨酸－半乳糖化膽固醇衍生物Gal2His2C42Chol（2），具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，能加速陽離子脂質(zhì)體從溶酶體釋放、進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過程，從而使細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯提高。此外，有研究者運(yùn)用某些輔助成分如多肽、多聚物等，利用其滲透作用或去垢劑類似作用機(jī)制使溶酶體破裂，轉(zhuǎn)染效率也可明顯提高 。

2.3 DNA的大小及構(gòu)型 研究表明質(zhì)粒DNA的大小 對(duì) 轉(zhuǎn) 染 效 率 有 很 大 影 響［6］。Katrien 等［7］以DOTAP/DOPE陽性脂質(zhì)體為基因載體，將3種構(gòu)型（超螺旋、開環(huán)和線型）的質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超螺旋質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率最高。Lukacs等［8］通過對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小于100bp的DNA片段可以在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中自由移動(dòng)。而隨著DNA片段的增大，其在細(xì)胞質(zhì)中的遷移能力也隨之降低。這是由于核孔對(duì)于進(jìn)入細(xì)胞核的DNA具有“尺寸限制功能”。此外，小分子DNA更容易與帶負(fù)電荷的物質(zhì)相互競爭交換而從LPP中解離出來。

2.4 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的正負(fù)電荷比例 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體中兩者的正負(fù)電荷比例是影響基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素。其中的一個(gè)重要原因是，兩者所帶電荷比例可直接影響復(fù)合體的粒徑；而當(dāng)lipoplexes的直徑尺寸在0.4～1.4μm 范圍內(nèi)時(shí)，具有更高的 轉(zhuǎn) 染 效 率［9，10］。Almofti等［11］通 過 電 鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的電荷比值為1時(shí)粒徑最大，認(rèn)為電荷比值為1時(shí)，脂質(zhì)體與DNA靜電斥力消失，易于集聚，大于或小于1時(shí)，產(chǎn)生靜電排斥作用使脂質(zhì)體DNA均勻分散。實(shí)驗(yàn)證明，脂質(zhì)體與DNA的電荷比在1∶1時(shí)，形成的復(fù)合體的粒徑最大，在體內(nèi)的半衰期延長，基因轉(zhuǎn)染效率最高［12，13］。另外，帶有稍微過剩陽離子的lipoplexes，其轉(zhuǎn)染效率更高［14］。

2.5 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的大小 陽離子脂質(zhì)體帶正電荷，核酸大分子帶負(fù)電。當(dāng)兩者混合時(shí)，可在瞬間發(fā)生相互作用而形成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體——lipoplexes［15］。lipoplexes的大小和形狀受陽離子脂質(zhì)體和DNA的摩爾比影響，且呈動(dòng)態(tài)變化。當(dāng)正負(fù)電荷比例接近1時(shí)，則有明顯的大小及結(jié)構(gòu)的改變［16］。Rejman等［17］2004在研究復(fù)合體的粒徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞作用的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，粒徑在200nm～1μm之間的粒子，其通過細(xì)胞膜內(nèi)陷作用進(jìn)入細(xì)胞的過程比較緩慢，使得DNA在到達(dá)溶酶體之前就從核內(nèi)體中釋放出來，避免其在溶酶體內(nèi)降解。而粒徑小于200nm的復(fù)合體在進(jìn)入細(xì)胞后，迅速被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)并發(fā)生降解。

2.6 生物學(xué)因素 當(dāng)轉(zhuǎn)染應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞時(shí)，受諸多生物學(xué)因素的干擾，例如DNA核酸酶對(duì)核酸的降解，體內(nèi)吞噬細(xì)胞活化后對(duì)DNA的清除作用以及血漿中帶電荷成分對(duì)陽離子的影響等。

2.6.1 細(xì)胞外干擾因素。在血清環(huán)境中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較低，其中一個(gè)重要原因是血清蛋白中和了脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物表面的正電荷，使其與帶負(fù)電的細(xì)胞表面的靜電作用受到影響。另外，血液中小分子脂類和大分子苷類可破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而降低其轉(zhuǎn)染效率。Xu等［18］通過實(shí)驗(yàn)觀察推測，血清和血漿成分可能使脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物過早地發(fā)生聚集、結(jié)構(gòu)改變與分解。針對(duì)此現(xiàn)象，有研究者用聚乙二醇等作為修飾成分，屏蔽陽離子脂質(zhì)體表面過多的正電荷，從而抑制復(fù)合體的聚集 ，同時(shí)可阻止lipoplexes與帶負(fù)電的血清蛋白相互作用［19］使復(fù)合體逃避巨噬細(xì)胞的清除。

2.6.2 細(xì)胞內(nèi)干擾因素。目前普遍認(rèn)為抑制DNA從核內(nèi)體中釋放的因素以及DNA進(jìn)入細(xì)胞核的干擾因素，均對(duì)陽性脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重要影響。細(xì)胞在有絲分裂時(shí)，外源性DNA更容易被細(xì)胞核攝取［20］。由此認(rèn)為，DNA進(jìn)入細(xì)胞核的一個(gè)主要機(jī)制是依賴于細(xì)胞分裂時(shí)的有絲分裂被動(dòng)進(jìn)入胞核。但對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染提示DNA也可以通過主動(dòng)運(yùn)輸穿過核膜。然而，在非有絲分裂的細(xì)胞中，粒徑比核孔大的DNA穿過核孔的機(jī)制還尚未清楚［20］。此外，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率還跟轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長狀態(tài)及融合程度等因素有關(guān)。

3 前景展望

在一系列非病毒載體中，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因傳遞系統(tǒng)是最有前景的傳遞系統(tǒng)之一。目前研究者發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同的靶細(xì)胞尋找高特異性的靶向性配體具有廣闊的前景［21］。例如，利用不同性能的分子材料，如親水性陽離子聚合物、表面活性劑、糖蛋白和多糖等對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，可在生物體內(nèi)的某個(gè)過程起到調(diào)控作用，從而提高轉(zhuǎn)染效率。

脂質(zhì)－復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)機(jī)制是基因轉(zhuǎn)染過程一個(gè)重要的限速步驟，如果能從信號(hào)分子以及具體作用機(jī)制的角度，詳細(xì)闡明影響轉(zhuǎn)染效率的因素，將有利于進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。

隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的不斷發(fā)展，陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因機(jī)制的研究將不斷深入，轉(zhuǎn)染過程中的影響因素也不斷得到闡明，從而為提高轉(zhuǎn)染效率提供重要的理論指導(dǎo)。

［1］Tresset G.The multiple faces of self－assembled lipidic systems〔J〕.PMC Biophysics，2009，2（1）：3.

［2］Kumar M，Jinturkar K，Yadav MR，et al.Gemini amphiphiles：a novel class of nonviral gene delivery vectors〔J〕.Crit Rev T－h(huán)er Drug Carrier Syst，2010，27（3）：237－278.

［3］Wasungu L，Hoekstra D.Cationiclipids，lipoplexes and intracellular delivery of genes〔J〕.J Control Release，2006，116（2）：255－264.

［4］Ma B，Zhang S，Jiang H，et al.Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery〔J〕.J Control Release，2007，123（3）：184－194.

［5］Shigeta K，Kawakami S，Higuchi Y，et al.Novel histidine－conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte－selective gene transfer in human hepatoma HepG2cells〔J〕.J Controll Release，2007，118（2）：262－270.

［6］Madeira C，Loura LM，Prieto M，et al.Liposome complexation efficiency monitored by FRET：effect of charge ratio，helper lipid and plasmid size〔J〕.Eur Biophys J，2007，36（6）：609－620.

［7］Katrien R，Nike NS，et al.Influence of plasmid DNA topology on the transfection properties of DOTAP/DOPE lipoplexes〔J〕.J Control Release，2006，115（3）：335－343.

［8］Lukacs GL，Haggie P，Seksek O，et al.Size－dependent DNA Mobility in Cytoplasm and Nucleus〔J〕.J Biol Chem，2000，275（3）：1625－1629.

［9］Van der Aa MA，Koning GA，d’Oliveira C，et al.An NLS peptide covalently linked to linear DNA does not enhance transfection efficiency of cationic polymer based gene de－livery systems〔J〕.J Gene Med，2005，7（2）：208－217.

［10］Esposito C，Generosi J，Mossa G，et al.The analysis of serum effects on structure，size and toxicity of DDAB－DOPE and DCChol－DOPE lipoplexes contributes to explain their different transfection efficiency〔J〕.Colloids Surf B Biointerfaces，2006，53（2）：187－192.

［11］Almofti MR，Harashima H，Shinohara Y，et al.Cationic liposome－mediated gene delivery：biophysical study and mechanism of internalization〔J〕.Arch Biochem Biophys，2003，410（2）：246－253.

［12］Majeti BK，Karmali PP，et al.In vitro gene transfer efficacies of N，N－dialkylpyrrolidinium chlorides：a structure－activity investigation〔J〕.J Med Chem，2005，48（11）：3784－3795.

［13］Fenske DB，Cullis PR.Entrapment of small molecules and nucleic acid－based drugs in liposomes〔J〕.MethodsEnzymol，2005，391：7－40.

［14］Farago O，Gronbech－Jensen N.Simulation of self－assembly of ocationic lipids and DNA into structured complexes〔J〕.J Am Chem Soc，2009，131（8）：2875－2881.

［15］Resina S，Prevot P，Thierry AR.Physico－chemical characteristics of lipoplexes influence cell uptake mechanisms and transfection efficacy〔J〕.PLoS One，2009，4（6）：e6058.

［16］Yang Y，Zhang Z，Chen L，et al.Effect of multifold charge groups and imidazole－4－carboxaldehyde on physicochemical characteristics and transfection of cationic polyphosphazenes/DNA complexes〔J〕.Int J Pharm，2010，390（2）：191－197.

［17］Rejman J，Oberle V，Zuhorn IS，et al.Size－dependent internalization of particles via the pathways of clathrin and caeolaemediated endocytosis〔J〕.Biochem J，2004，377（1）：159－169.

［18］Xu L，Anchordoquy TJ.Cholesterol domains in cationic lipid/DNA complexes improve transfect ion〔J〕.Biochim Biophys Acta，2008，1778（10）：2177－2181.

［19］Ramezani M，Khoshhamdam M，Dehshahri A，et al.The influence of size，lipid composition and bilayer fluidity of cationic liposomes on the transfection efficiency of nano－lipoplexes〔J〕.Colloids Surf B Biointerfaces，2009，72（1）：1－5.

［20］Araujo NM，Vianna CO，Moraes MT，et al.Expression of Hepatitis B virus surface antigen（HBsAg）from genotypes A，D and F and influence of amino acid variations related or not to genotypes on HBsAg detection〔J〕.Braz J Infect Dis，2009，13（4）：266－271.

［21］Mukthavaram R，Marepally S，Venkata MY，et al.Cationic glycolipids with cyclic and open galactose head groups for the selective targeting of genes to mouse liver〔J〕.Biomaterials，2009，30（12）：2369－2384.