頭孢泊肟酯片微生物限度檢查方法的建立

范震洪，黃佳

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥劑科，北京 100050

頭孢泊肟酯片為口服第三代頭孢菌素類藥物，具有廣譜、殺菌力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。為保證臨床應(yīng)用的安全性，目前各國藥典不僅對注射用藥品規(guī)定必須進(jìn)行無菌檢查，而且對口服制劑的微生物污染狀況也有明確的質(zhì)控指標(biāo)[2-6]。在對具有抗菌活性的藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗菌活性去除的是否徹底，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的有效性[7]。薄膜過濾法是去除藥品中抗菌成分的最有效方法。但由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，使得無法簡單采用水溶液作為沖洗劑去除抗菌成分。大量的沖洗，不僅影響濾膜的孔徑，使截留在膜上的細(xì)菌濾過，而且還使污染的細(xì)菌受到損傷，從而降低陽性檢出率，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用β-內(nèi)酰胺酶能使β-內(nèi)酰胺類抗生素失去抗菌活性的特點(diǎn)[8-13]，在培養(yǎng)基中加入β-內(nèi)酰胺酶作為中和劑，可有效地去除頭孢泊肟酯片的抑菌作用，據(jù)此，建立了頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法；并對實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)操作(SOP)方法進(jìn)行了探討。

1 儀器與材料

WJ-6無菌檢查儀(天津市羅根科技有限公司)，800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械十廠)，YJA型勻漿儀(臺州市椒江五星機(jī)械儀器有限公司)，一次性薄膜過濾器(規(guī)格：NS01-75D2，批號：201100209；孔徑：0.45μm；材質(zhì)：尼龍膜)，生化培養(yǎng)箱(德國Binder公司)。頭孢泊肟酯片(50mg/片)：海南海靈制藥廠。

培養(yǎng)基為膽鹽乳糖增菌液、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂(批號分別為01104192、0110828、0110314、0110808、0110902、0110520，北京三藥科技開發(fā)有限公司，靈敏度實(shí)驗(yàn)符合《中華人民共和國藥典》2010規(guī)定[2]附錄107-113)。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC-B63501]、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC-B 26003]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC-B 44102]、白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC-F 98001](中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心)，黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC-F 98003](中國藥品生物制品檢定所)。

β-內(nèi)酰胺酶：300萬單位/mL(中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法

參照2010年版《中華人民共和國藥典》二部微生物限度檢查法[2]附錄107-113實(shí)驗(yàn)，簡述如下。

2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu[2]附錄107-113的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液[2]附錄94。

2.2 供試液制備 稱樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100mL至無菌的勻漿罐中，勻漿2 min(3000r/min)，制成質(zhì)量濃度為100g/L的供試液，將此供試液離心5min(500r/min)，取上清液備用。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 平皿法 取質(zhì)量濃度為100g/L的供試液1mL入1個(gè)平皿，加入驗(yàn)證菌，然后每皿加約20mL營養(yǎng)瓊脂作細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂作霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。

2.3.2 薄膜過濾法 取供試品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，在最后一次的沖洗液中，加入驗(yàn)證菌，濾過后，將薄膜貼至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2.4 控制菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取供試品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜加至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的100mL膽鹽乳糖增菌液后，再加入菌數(shù)為50～100cfu的大腸埃希菌懸液，30～35℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 微生物限度檢查法的建立 由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，但對霉菌和酵母菌基本無抗菌活性[1]，為快速建立有效的微生物限度檢查方法，我們采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查和控制菌檢查，采用平皿法進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查；結(jié)合2010年版中國藥典中規(guī)定的常用驗(yàn)證菌株[2]，選擇枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]為細(xì)菌的代表菌株，白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F) 98001]為霉菌和酵母菌的代表，分別進(jìn)行薄膜過濾法和平皿法實(shí)驗(yàn)條件的篩選；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件篩選的菌株稱為篩選菌株[8-13]。

采用平皿法檢查頭孢泊肟酯片時(shí)，樣品經(jīng)1:200稀釋后對篩選菌株白色念珠菌的回收率平均為94%，在此條件下，用黑曲霉進(jìn)一步驗(yàn)證，其回收率也平均為97%。說明常規(guī)的平皿法(1:200)，即可滿足頭孢泊肟酯片霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查的需要。

采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，去除頭孢泊肟酯片的抗細(xì)菌活性，當(dāng)沖洗量為300mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的回收率平均為85%，而金黃色葡萄球菌的回收率平均為91%(表1)，提示頭孢泊肟酯片對枯草芽孢桿菌較金黃色葡萄球菌更敏感，故僅采用枯草芽孢桿菌作為篩選菌株即可滿足實(shí)驗(yàn)條件篩選的需要(表1)，證明了方法的有效性。

結(jié)合細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行控制菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。當(dāng)采用薄膜過濾法結(jié)合在培養(yǎng)基中加入中和劑的方法，且總沖洗量為300mL(100mL/次)時(shí)，已能滿足控制菌檢查的基本要求。

驗(yàn)證試驗(yàn)中篩選菌株的意義在于明確指征藥品的抑菌成分是否被消除，如篩選菌株生長良好，則說明供試品在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，可以照此檢驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證；如其它陽性菌在此條件下生長微弱、緩慢或不生長者，則說明該檢驗(yàn)條件未能完全去除該藥物的抑菌作用，應(yīng)對檢驗(yàn)條件進(jìn)一步調(diào)整以達(dá)到完全去除供試品抑菌成分的目的。因此篩選菌株選擇的正確與否是能否實(shí)現(xiàn)快速建立抗菌藥物微生物限度檢查方法的關(guān)鍵。

3.2 實(shí)驗(yàn)操作對結(jié)果的影響

3.2.1中和劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 由于頭孢泊肟酯片具有較強(qiáng)的抗菌活性，單純采用薄膜過濾法，不能去除頭孢泊肟酯片的抗菌活性，β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)作為中和劑，在β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳上結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時(shí)發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其成為開環(huán)物，從而重建了β-內(nèi)酰胺酶，或是與頭孢泊肟酯片的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使頭孢泊肟酯片失活[14,15]。故確定β-內(nèi)酰胺酶作為中和劑。對中和劑的加入量進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)中和劑的加入量過小，不能完全消除藥物的抗菌活性；中和劑加入量過大，會造成不必要的浪費(fèi)，容易污染[9]。以2mLβ-內(nèi)酰胺酶作為中和劑，可滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

3.2.2 培養(yǎng)基和沖洗液的溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 由于β-內(nèi)酰胺酶在55℃時(shí)活性較高[16]，所以制備含β-內(nèi)酰胺酶平板時(shí)，培養(yǎng)基的溫度應(yīng)控制55±5℃之間。進(jìn)行薄膜過濾時(shí)，如沖洗液的溫度較低，藥物及其輔料不能充分溶解，易堵塞薄膜；適當(dāng)提高沖洗液的溫度至45℃時(shí)，可以增加供試液的濾過性，降低頭孢泊肟酯片在薄膜上的吸附；但沖洗液的溫度大于45℃，容易傷害藥品中污染的雜菌，影響檢驗(yàn)結(jié)果。

3.3頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法操作的SOP 稱樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100mL至無菌的勻漿罐中，勻漿2min(3000r/min)，制成質(zhì)量濃度為100g/L的供試液，將此供試液離心5 min(500r/min)，取上清液備用。

取1:10的供試液，采用平皿法1mL/皿，測定霉菌和酵母菌數(shù)。

取供試品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜貼至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，測定細(xì)菌數(shù)。

取供試品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀釋至100mL，全量通過薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液沖洗薄膜2次，每次100mL，將薄膜加至含2mLβ-內(nèi)酰胺酶的100mL膽鹽乳糖增菌液中，測定控制菌。

3.4 對頭孢泊肟酯片微生物限度檢查法驗(yàn)證工作的思考 由于β-內(nèi)酰胺類抗生素具有相似的抗菌活性，因此，對本文未涉及的β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢唑啉、替卡西林等[17,18]，可以根據(jù)相應(yīng)藥物的原始實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，直接選用其敏感菌株，例如枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的篩選。選擇實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，最重要的是確定中和劑的最佳加入量，使其既可以完全消除藥物的抗菌活性，又不會由于過量出現(xiàn)污染和浪費(fèi)。

通常，當(dāng)藥品生產(chǎn)條件發(fā)生改變(如更換產(chǎn)地、更換輔料、改變生產(chǎn)工藝等)或檢測條件發(fā)生改變(改換檢測實(shí)驗(yàn)室等)時(shí)，對微生物限度檢查方法應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。由于進(jìn)行再驗(yàn)證時(shí)，藥品中的活性成分未發(fā)生改變，故其抗菌譜也未改變，因此我們認(rèn)為再驗(yàn)證工作僅需針對藥典規(guī)定的全部驗(yàn)證菌株中的最敏感菌株即可，而不必對全部菌株再進(jìn)行驗(yàn)證。即對頭孢泊肟酯片進(jìn)行再驗(yàn)證時(shí)，僅需證明實(shí)驗(yàn)中最敏感菌株(枯草芽孢桿菌)的回收率大于70%，即可說明檢查方法有效，而無需再逐一驗(yàn)證大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。采用這種方法，即可保證檢驗(yàn)方法的有效性，又節(jié)省了大量人力、物力，使得驗(yàn)證工作成為日常檢驗(yàn)的一部分成為可能。建議藥典逐漸收載各抗菌藥物的最敏感驗(yàn)證菌株作為質(zhì)控菌株，方便日常工作。

[1] 韓靜,楊漫,宋玉環(huán).頭孢泊肟酯片人體相對生物利用度和生物等效性[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,20011,25(1):440-443.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:二部[S].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2010: 附錄94,107-113.

[3] British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia:Apendix XVI B A [S]. London: The Stationery Office ,2002: 315.

[4] Pheur Commission. Europe Pharmacopoeia5.2 [S].Strasbourg:Pheur Commission ,2005: 2613.

[5] The United States Pharmacopeial Convention. U.S Pharmacopeia/ National Formulary28 [S]. Washington : U.S Pharmacopeia Origination Press,2005:2752.

[6] Japanese Pharmacopoeia Commission. The Japanese Pharmacopoeia 14th [S]. Tokyo: Hirogawa Bookshop ,2000:60.

[7] 李玉芹.淺談目前無菌檢查和微生物限度檢查存在的問題[J].中國藥事,2007,21(12):1011-1012.

[8] 祝玲,祝紅.薄膜過濾法在頭孢呋辛酯片控制菌檢查中的應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥,2009,22(1):26-27.

[9] 錢文靜,蔡美明.酶處理與薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類抗生素的無菌檢查[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究,2004,12(5):70-72.

[10] 孫春艷,張春瑛,沈佳特.注射用頭孢菌素?zé)o菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證[J],醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,26(9):1089-1091.

[11] 錢維清,岳劍鋒.β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶處理法無菌檢查[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2003,4(2):53-54.

[12] 徐宏,鄒貴田.酶處理法在β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)o菌檢查中的應(yīng)用[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,24(2):63-65.

[13] 李瑋,許威,馬仕洪.15種注射用頭孢菌素?zé)o菌檢查方法研究[J].中國藥房,2007,18(25):1971-1973.

[14] 李霜,李詠梅.β-內(nèi)酰胺酶及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2006,27(3):171-174.

[15] 李金鐘,劉利平.β-內(nèi)酰胺酶與治療抗生素選擇[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,28,(6):566-568.

[16] 張鳳凱,張楓.蠟樣芽孢桿菌CMCCB63301產(chǎn)生青霉素酶的特性及其應(yīng)用的研究[J].藥物分析雜志,1999,19(3):158-161.

[17] 劉菘.論頭孢菌素類藥物[J].黑龍江科技信息,2007,(16):209.

[18] 孫瑞萍,孫淑華.新型β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點(diǎn)與臨床應(yīng)用[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2004(7):16.