3種體細(xì)胞共培養(yǎng)體系對(duì)昆明鼠早期胚胎體外發(fā)育潛力的影響研究

李 娟 蓋 凌 魏 斌 王洪巖 王磊光 邱 毅 張 琦 于小潔

山東省計(jì)劃生育科研所，山東省優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(濟(jì)南，250002)

已有的研究表明，胚胎在體外培養(yǎng)與體內(nèi)生長(zhǎng)其形態(tài)學(xué)和發(fā)育速度均存在差異。隨著培養(yǎng)液的不斷改進(jìn)，胚胎的體外發(fā)育率得到了很大提高，但目前所用的各種培養(yǎng)系統(tǒng)還不能完全模擬體內(nèi)胚胎供給環(huán)境，胚胎的發(fā)育率及質(zhì)量仍存在很多問題。如何改善胚胎體外生長(zhǎng)環(huán)境，提高胚胎質(zhì)量與發(fā)育潛能，一直是研究的熱點(diǎn)。胚胎體外培養(yǎng)中使用共培養(yǎng)由來已久，先后使用過多種輔助細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)，如人及牛輸卵管上皮細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等。但是人們對(duì)共培養(yǎng)的益處尚無(wú)一致意見。本研究采用人卵丘細(xì)胞、昆明鼠卵丘細(xì)胞、昆明鼠成纖維細(xì)胞等3種共培養(yǎng)體系與昆明鼠早期胚胎共培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況，篩選適宜體外培養(yǎng)條件，探討早期胚胎理想生存環(huán)境。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

1．1．1 試劑 孕馬血清(寧波第二激素廠)，人絨毛膜促性腺激素(hCG，麗珠制藥廠)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco公司)，絲裂霉素 －C(Sigma公司)，透明質(zhì)酸酶(Sigma公司)，IVC序貫培養(yǎng)液(IVC－ONE液、IVC －TWO 液、IVC，美國(guó))，Hoechst染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1．1．2 儀器 解剖顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Nikon)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Galaxy)。

1．2 方法

1．2．1 人卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)體系制備 人卵丘細(xì)胞取自因男方因素不育需做卵胞漿內(nèi)單精子注射的女性患者，取卵后獲得的卵冠丘復(fù)合體用80U/ml透明質(zhì)酸酶分離卵子和卵丘細(xì)胞。收集卵子用于卵胞漿內(nèi)單精子注射;卵丘細(xì)胞迅速收集在離心管中，加IVC－ONE液 4～6ml混勻，1 000rpm/min離心5min，去上清，加IVC－ONE液調(diào)密度為卵丘細(xì)胞5×104/ml，制成 50μl/滴的人卵丘細(xì)胞液滴，置37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)卵丘細(xì)胞貼壁伸展后，更換IVC－ONE液，用于共培養(yǎng)。

1．2．2 昆明鼠卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)體系制備 昆明鼠由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。選取7～8周齡陰道口呈粉紅的昆明白雌性小鼠，腹腔注射孕馬血清10U/只，48h后腹腔注射hCG 10U/只，并與正常雄鼠合籠(雌雄比為2:1)，12h后觀察雌鼠有無(wú)陰道栓形成;斷頸處死有陰道栓的小鼠，在解剖鏡下剝離輸卵管，用TB針剝開輸卵管壺腹部，收集卵冠丘復(fù)合物，用80U/ml透明質(zhì)酸酶分離受精卵和卵丘細(xì)胞。受精卵置IVC－ONE液培養(yǎng)至2細(xì)胞后隨機(jī)分配給各共培養(yǎng)體系;收集卵丘細(xì)胞加培養(yǎng)液調(diào)密度為5 ×104/ml，制成50μl的液滴，放37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)卵丘細(xì)胞貼壁伸展后，更換IVC－ONE液，用于共培養(yǎng)。

1．2．3 昆明鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系制備 取孕13．5d昆明小鼠的胚胎，去除頭、尾、內(nèi)臟和四肢后，用眼科剪剪成約1mm組織塊，用0．25%的胰蛋白酶室溫消化3～5min后吹打收集細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)大部分細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液，以后隔天換液，逐天觀察，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代。將傳至3～4代的鼠胚成纖維細(xì)胞加入含10μg/ml絲裂霉素－C的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3h后，常規(guī)胰酶消化，單細(xì)胞懸液按密度5×104/ml制成50μl的液滴，當(dāng)成纖維細(xì)胞貼壁伸展后，更換IVC－ONE液，用于共培養(yǎng)。

1．3 胚胎體外培養(yǎng)分組

將獲得的已發(fā)育到2細(xì)胞期的鼠胚胎分別置于上述3組及對(duì)照組液滴中培養(yǎng)，36h后更換IVCTWO培養(yǎng)液。

1．4 胚胎體外發(fā)育觀察

每日上午8時(shí)觀察胚胎發(fā)育情況，連續(xù)觀察3d;記錄培養(yǎng)24h時(shí)發(fā)育到4～8細(xì)胞胚胎數(shù)，48h發(fā)育到桑葚胚數(shù)，72h發(fā)育到囊胚數(shù)。早囊胚為出現(xiàn)囊胚腔，胚胎直徑未變，透明帶無(wú)明顯變化;擴(kuò)張期囊腔為囊腔擴(kuò)張，直徑大于最初的胚胎直徑，透明帶變薄。

1．5 囊胚總細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡數(shù)計(jì)數(shù)

培養(yǎng)72h的囊胚胚胎用Hoechst染色試劑盒染色，計(jì)數(shù)囊胚總細(xì)胞數(shù)目及囊胚細(xì)胞凋亡數(shù)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)染色質(zhì)固縮，Hoechst染色時(shí)細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染。

2 結(jié)果

2．1 擴(kuò)張囊胚形成率和總囊胚形成率

培養(yǎng)24～48h時(shí)到達(dá)4～8細(xì)胞及桑葚胚的比例4組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05);培養(yǎng)72h時(shí)擴(kuò)張囊胚形成率和總的囊胚形成比例人卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)組分別為54．17%、61．67%，鼠卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)體組分別為53．85%、68．13%，鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組分別為 51．40%、65．42%，對(duì)照組分別為34.38、45.31%，共培養(yǎng)3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

2．2 囊胚總細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率

人卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)組囊胚總細(xì)胞數(shù)平均71．26個(gè)，細(xì)胞凋亡率7．68%;鼠卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)組囊胚總細(xì)胞數(shù)平均76．52個(gè)，細(xì)胞凋亡率7．44%;鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組囊胚總細(xì)胞數(shù)平均64．41個(gè)，細(xì)胞凋亡率8．46%;對(duì)照組囊胚總細(xì)胞數(shù)平均38．57個(gè)，細(xì)胞凋亡率16．28%。共培養(yǎng)3組間囊胚總細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，但與對(duì)照組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。見表2。

表1 各組共培養(yǎng)體系體外胚胎培養(yǎng)發(fā)育情況

表2 各組共培養(yǎng)體系體外細(xì)胞培養(yǎng)囊胚細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞凋亡數(shù)目情況

3 討論

3．1 共培養(yǎng)體系對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響

胚胎與體細(xì)胞共培養(yǎng)的目的是為了最大限度地滿足胚胎在不同細(xì)胞期對(duì)物質(zhì)的全面需求，為早期胚胎營(yíng)造一種理想的生存環(huán)境。本研究中將每只小鼠的胚胎隨機(jī)分成4組，通過自身對(duì)照排除了小鼠個(gè)體差異帶來的影響，并觀察不同共培養(yǎng)體系對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組與對(duì)照組發(fā)育到4～8細(xì)胞期及桑葚期的胚胎率均無(wú)差異，但發(fā)育的囊胚率共培養(yǎng)組均明顯高于對(duì)照組，尤其是擴(kuò)張囊胚率顯著提高，而各共培養(yǎng)組間囊胚率無(wú)差異。說明不同種屬、不同組織來源的共培養(yǎng)細(xì)胞均有改善體外培養(yǎng)環(huán)境的能力。這一結(jié)果與O-mar Farouk［1］和 Wang［2］等研究一致。

3．2 共培養(yǎng)體系對(duì)囊胚細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率的改善

囊胚質(zhì)量由囊胚細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率來衡量，囊胚細(xì)胞數(shù)是反映囊胚發(fā)育潛力最敏感的指標(biāo)之一，囊胚細(xì)胞凋亡率與移植后胚胎發(fā)育潛力成負(fù)相關(guān)。本研究觀察的3組共培養(yǎng)體系之間囊胚細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與對(duì)照組比較存在差異，說明共培養(yǎng)體系提高了胚胎細(xì)胞分裂速度，降低了細(xì)胞凋亡率;將體細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與胚胎共培養(yǎng)，在一定程度上能夠克服胚胎體外發(fā)育阻滯，促進(jìn)早期胚胎發(fā)育，提高胚胎質(zhì)量，增加囊胚形成率，這一結(jié)果與相關(guān)研究［3～7］報(bào)道一致。

3．3 共培養(yǎng)體系的生理協(xié)同作用

在生理活動(dòng)中，單個(gè)細(xì)胞雖然能生長(zhǎng)繁殖，但不如群體細(xì)胞生存力強(qiáng)，多細(xì)胞量更易于培養(yǎng)，說明細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長(zhǎng)增殖。有研究認(rèn)為胚胎密度及胚胎間的距離決定胚胎發(fā)育能力，胚胎在發(fā)育過程中能分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ和Ⅱ，血小板激活因子，血小板源生長(zhǎng)因子等促進(jìn)胚胎體外發(fā)育的因子，因此最佳的培養(yǎng)密度取決于胚胎發(fā)育過程中胚胎因子的分泌數(shù)量［8～11］。Ando 等［12］對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成的永生細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分泌細(xì)胞因子情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，存在有高濃度的白介素、白血病抑制因子(LIF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;Spandorfer等［13］在子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到高濃度的LIF;Parikh等［14］在人顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中檢測(cè)到高濃度的白介素－6、胰島素樣生長(zhǎng)因子－I及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;鼠成纖維細(xì)胞也可以分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖［15，16］。這些發(fā)現(xiàn)說明不同類型的體細(xì)胞既會(huì)分泌一種與細(xì)胞類型無(wú)關(guān)的相同成分，同時(shí)又會(huì)分泌與細(xì)胞類型相關(guān)的特異性因子，使胚胎在共培養(yǎng)系統(tǒng)中處于生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子濃度升高的動(dòng)力學(xué)環(huán)境中，促進(jìn)胚胎發(fā)育。

本研究顯示，不同類型的體細(xì)胞共培養(yǎng)體系均可在體外為胚胎發(fā)育提供一種類似于體內(nèi)環(huán)境、有利于胚胎體外發(fā)育的生長(zhǎng)條件。動(dòng)物自體顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，既可提高胚胎體外培養(yǎng)效率，又能避免種屬間交叉污染，而且顆粒細(xì)胞伴隨取卵獲得，取材方便。不足之處是顆粒細(xì)胞質(zhì)量無(wú)法選擇，不便于質(zhì)量控制。鼠成纖維細(xì)胞可以成批大量培養(yǎng)，冷凍保存，便于長(zhǎng)期使用和質(zhì)量控制，如果能消除種屬間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系將是一個(gè)很好的選擇。共培養(yǎng)促進(jìn)胚胎體外發(fā)育的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討，為胚胎工程的發(fā)展提供新思路。

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