高脂乳對大鼠神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生及其機(jī)制的初步研究

何 鑫，胡金鳳，楚世峰，齊孟和，3，吳苗苗，陳乃宏

(1.天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;3.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059)

炎癥是一個對外來入侵(如壓力、外傷、感染等)進(jìn)行復(fù)雜的細(xì)胞及分子應(yīng)激并試圖抵抗這種入侵的過程［1］。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的炎癥反應(yīng)(神經(jīng)炎癥)是腦中小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活并使得細(xì)胞因子、趨化因子、神經(jīng)遞質(zhì)和氧自由基(ROS)等炎癥介質(zhì)釋放的過程［2］。神經(jīng)炎癥的發(fā)生與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。神經(jīng)退行性疾病包括阿爾采末病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮，tauopathies、年齡相關(guān)的黃斑退化等，研究表明［3］，在這些疾病的病理現(xiàn)象中均觀察到神經(jīng)炎癥的發(fā)生。

大量的研究報道稱現(xiàn)今社會的發(fā)展致使人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，高脂飲食充斥人們的生活。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大量的攝入膽固醇及脂肪使得高脂血癥頻發(fā)，進(jìn)而引起其它的病變?nèi)绶逝职Y、腦血栓、冠心病、脂肪肝、高血壓、糖尿病、腦卒中及一些神經(jīng)退行性疾病等［4］。并且，高脂飲食導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病伴隨著神經(jīng)炎癥的發(fā)生，也有很多研究者對此進(jìn)行了大量的實(shí)驗研究，但是所采用的高脂飲食模型的造模方法均是通過給予高脂飼料進(jìn)行飼養(yǎng)［5－7］，該方法是由動物自由攝取高脂飼料，其攝入量不可控，從而使得動物模型組內(nèi)差異較大。而如若定量通過灌胃給予高脂乳，動物攝取脂肪及膽固醇的量變?yōu)榭煽氐?，可縮小動物組內(nèi)差異，而使模型較穩(wěn)定。所以本文致力于定量給予高脂乳造模研究其對神經(jīng)炎癥的激發(fā)及相關(guān)機(jī)制。

1 方法

1.1 動物及分組 SD大鼠，30只，♂，體質(zhì)量240～270 g;北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2009-0017］。

1.2 造模方法 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組，每組15只。空白組灌胃給水，1 ml/100 g，模型組灌胃給予高脂乳(高脂乳配方:油相－豬油100 g，膽固醇40 g，膽酸鈉 4 g;水相－水 120 ml，丙二醇 80 ml，吐溫-80 100 ml，丙硫氧嘧啶 4 g)，1 ml/100 g，兩組自由飲食飲水，造模2個月。

1.3 Western blot分析蛋白表達(dá)及磷酸化水平大鼠斷頭取腦后，冰上分離海馬、皮層、紋狀體。按100 g·L－1的稀釋比例，用組織勻漿器勻漿，勻漿液4℃，12 000×g離心20 min，收集上清。采用 BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，加入上樣緩沖液煮沸變性。蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉2h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗滌3次后加上HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，再經(jīng)TBS-Tween洗滌3次后加上ECL發(fā)光液進(jìn)行檢測。

1.4 ELISA法檢測炎癥因子含量 海馬、皮層、紋狀體組織勻漿同上。勻漿液4℃，12 000×g離心10 min，收集上清。按照大鼠ELISA試劑盒操作說明測定腦勻漿液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。

Fig 1 Expression of OX42 and GFAP in hippocampus，cortex and striatum of rats fed on high-fat dairy is determined by Western blot(n=5)

1.5 免疫組織化學(xué)觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活 造模結(jié)束后，10%水合氯醛350 mg·kg－1腹腔麻醉大鼠。4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流，取腦置于甲醛溶液中固定24小時后，石蠟包埋、切片(片厚8 μm)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，92℃枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中抗原熱修復(fù)10 min，室溫冷卻30 min，加入3%雙氧水室溫作用10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，非特異性位點(diǎn)用羊血清室溫封閉15 min。加一抗GFAP稀釋液(1∶50)4℃過夜，加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育1 h，再加三抗37℃孵育1 h。DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)。常規(guī)脫水至透明，中性樹膠封片。采用正置顯微鏡觀察膠質(zhì)細(xì)胞在不同部位的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 高脂乳對小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性的影響 OX42、GFAP分別是小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，本實(shí)驗采用Western blot檢測了高脂乳對這兩種蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而確定高脂乳對神經(jīng)炎癥細(xì)胞激活的影響。實(shí)驗結(jié)果如Fig 1所示，與空白組相比，高脂飲食可明顯增加大鼠腦海馬、皮層、紋狀體OX42、GFAP表達(dá)量，表明高脂乳可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。Fig 2實(shí)驗結(jié)果表明，高脂乳可使星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變:細(xì)胞膨脹、肥大，突起變長，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活。

Fig 2 Immunohistochemical analysis of GFAP expression in hippocampus and cortex of rats fed on high-fat dairy

2.2 高脂乳對炎癥因子產(chǎn)生及COX2表達(dá)的影響ELISA試劑盒檢測結(jié)果表明，高脂乳能使大鼠海馬、皮層、紋狀體產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量與空白組比明顯增加(Fig 3)。并且，COX2在炎性因子刺激下可被激活，高脂乳能使大鼠腦的海馬、皮層、紋狀體的COX2的表達(dá)量明顯增加(Fig 4)，提示COX2被激活。

Fig 3 Effect of high-fat dairy on the content of TNF-α and IL-1β in hippocampus，cortex and striatum of rats detected by ELISA kits(n=5)

2.3 高乳脂對MAPKs表達(dá)的影響 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是廣泛表達(dá)的絲氨酸/酪氨酸激酶，包括3個主要家族:ERKs、JNKs和p38 MAPKs，研究表明，其在炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長等多種生理和病理過程中起重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，高脂乳可使大鼠腦海馬、皮層、紋狀體的p38、JNK、ERK磷酸化水平與空白組比增加，但其表達(dá)量無改變(Fig 4)，提示MAPK可能參與高脂乳激活的神經(jīng)炎癥過程。

3 討論

本實(shí)驗研究了高脂乳對SD大鼠腦海馬、皮層、紋狀體內(nèi)神經(jīng)炎癥的激活情況，結(jié)果表明，高脂乳能夠激活上述部位的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，使TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生增加，COX-2表達(dá)增加，引發(fā)腦內(nèi)炎癥，作用機(jī)制可能與激活了MAPK信號通路有關(guān)。

高脂飲食損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)已得以確定，但其致病機(jī)制尚不明確。近年很多研究報道高脂飲食引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能是由于它激活神經(jīng)炎癥而導(dǎo)致的。而定量給予高脂乳，模型可控、較穩(wěn)定。并且高脂乳所致動物腦內(nèi)炎癥未見報道，所以本實(shí)驗對高脂乳所致神經(jīng)炎癥的激活進(jìn)行了研究。實(shí)驗結(jié)果表明，高脂乳可增加海馬、皮層、紋狀體內(nèi)神經(jīng)炎癥細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物表達(dá)量，使TNF-α和 IL-1β的產(chǎn)生增加，COX-2表達(dá)增加，從而證實(shí)高脂乳也可激活腦部神經(jīng)炎癥。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是參與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活表現(xiàn)在形態(tài)和功能改變兩方面，形態(tài)觀察可見起激活時胞體腫脹、突起增長，功能改變即在激活時會大量分泌不同的免疫調(diào)節(jié)肽，如細(xì)胞活素類(TNF-α和IL-1β)、趨化因子及一些非特異性的炎癥因子［8］。星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后細(xì)胞腫脹，并大量增生，產(chǎn)生炎性蛋白(COX2)及炎性因子［9］。本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可增加小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白OX42以及星形膠質(zhì)標(biāo)記物GFAP，而且免疫組化結(jié)果也顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞膨脹、肥大，突起變長，表明這兩種炎癥細(xì)胞被激活。COX2是催化花生四烯酸合成PGE2過程中的限速酶，據(jù)報道COX2與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［10］。本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)高脂乳促進(jìn)COX2蛋白表達(dá)，提示高脂乳可能通過促進(jìn)COX2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGE2合成而發(fā)揮神經(jīng)炎癥作用，但其對COX2酶活性有無影響有待于進(jìn)一步研究。

MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種細(xì)胞過程。經(jīng)典的MAPK主要包括ERK、JNK、p38三個亞族，近年來也發(fā)現(xiàn)另一亞族ERK5/BMK1。激活的MAPK可通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、酶類等多種底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程［11］。研究也發(fā)現(xiàn)，MAPK能被多種炎性刺激所激活，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子生成中起著重要的作用，表明其對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用［12］。我們的研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生神經(jīng)炎癥的部位——海馬、皮層、紋狀體，也觀察到 ERK、p38、JNK通路的激活，提示MAPK通路的激活可能參與高脂乳所致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程。

總之，本研究對高脂乳導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，證實(shí)了高脂乳可能通過激活MAPK途徑介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展，這為闡釋高脂飲食所致神經(jīng)退行性疾病提供了理論依據(jù)。

Fig 4 Expression of high-fat dairy on the expression of COX2，ERK，JNK and p38 MAPK and the phosphorylation of MAPK in hippocampus，cortex and striatum of rats determined by Western Blot(n=5)

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