內(nèi)皮素-1活化ROCK/SLUG誘導人卵巢癌細胞發(fā)生上皮向間充質(zhì)轉分化

張阿麗，張 弓，彭 晉，王全勝，馬 歡，鐘亞華，周福祥，謝叢華

(1.武漢大學中南醫(yī)院放化療科，武漢大學中南醫(yī)院腫瘤生物學行為湖北省重點實驗室，湖北省腫瘤醫(yī)學臨床研究中心，湖北武漢 430071;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結合科，湖北武漢 430022)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤的首要致死原因，2010年美國新報告卵巢癌患者21 880人，全年有13 850例卵巢癌患者死亡［1］。上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉型(epithelial to mesenchymal transition，EMT)可使癌細胞獲得遷移、侵襲和轉移的能力，從而在腫瘤轉移中有重要的作用。因為內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)及內(nèi)皮素受體(ETAR)在卵巢癌原發(fā)灶和轉移灶中高表達［2］，而且在腫瘤細胞中，ET-1/ETAR 自分泌通路通過誘導其纖維樣和侵襲表型，從而促進腫瘤細胞EMT。ROCK為Rho GTPases的下游效應分子，可以調(diào)節(jié)細胞骨架的組裝以及細胞黏附斑的形成，在EMT中起重要作用［3］。轉錄因子SLUG在卵巢癌細胞EMT中也起重要作用［4］。目前，ROCK與SLUG的關系，以及它們在ET-1誘導上皮卵巢癌細胞發(fā)生EMT中的作用還未見報道。本研究以人卵巢癌細胞SK-OV-3和CaOV3為研究對象，通過給予ET-1刺激或激活ROCK等，觀察該細胞侵襲能力及EMT表型相關基因的改變以及轉錄因子SLUG的變化，探討ROCK/SLUG通路在ET-1誘導上皮卵巢癌細胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與抗體 人卵巢癌細胞SK-OV-3，CaOV3購自武漢大學生物醫(yī)學保藏中心，培養(yǎng)在含1% 青－鏈霉素和10%FBS的RPMI 1640(美國Invitro-gen公司)中。兔抗纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)抗體，鼠抗β-actin抗體和兔抗ROCK抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗 E-cadherin抗體(美國 Zymed公司)。

1.2 細胞免疫熒光染色 培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640中的SK-OV-3和CaOV3(1×105/孔)生長在蓋玻片上24 h，無血清過夜后，用ET-1(美國MP Biomedicals公司)處理24 h，在－20℃用甲醇固定20 min，用5%正常羊血清封閉，β-tubulin抗體(美國Zymed公司，1∶100)4℃孵育過夜，PBS漂洗后，F(xiàn)ITC標記的二抗室溫孵育1 h后，用Nikon E-clipse E600熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及β-tubulin微管蛋白的表達，細胞核用PI染色。

1.3 Boyden小室體外侵襲實驗 Boyden小室體外侵襲實驗用于確定細胞的體外穿過基質(zhì)膠Matrigel的能力，方法參見文獻［5］。實驗設計①:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激10 h后固定并用Diff-quick染色(美國VWR Scientific公司)，每個孔計數(shù)5個視野的細胞數(shù)均數(shù)，每個孔設3個復孔。實驗設計②:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時加入ROCK抑制劑Y27632(LY)，或單用ROCK顯性激活的突變體轉染，同時設無處理的細胞為對照組，24 h后固定并用Diff-quick染色(美國VWR Scientific公司)，每孔計數(shù)5個視野的細胞均數(shù)，每個孔設3個復孔。

1.4 蛋白的提取和Western blot檢測 實驗設計①:SK-OV-3和CaOV3無血清培養(yǎng)過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激24 h收集樣本，以未刺激的細胞為對照組。用RIPA裂解液(美國Pierce公司)提取細胞蛋白，參照我們前期的方法［6］，Western blot檢測E-cadherin和纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的表達;實驗設計②:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時加入ROCK抑制劑Y27632(LY)，或單用ROCK顯性激活的突變體轉染，同時設無處理的細胞為對照組。用RIPA裂解液(美國Pierce公司)提取細胞蛋白，參照我們前期的方法［6］，Western blot檢測ROCK和FN的表達。

1.5 總RNA提取和實時定量PCR檢測 實驗方案①:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1 刺激，分別在 0，3，6，12，24 h收集細胞，檢測SLUG、Snail和Twist轉錄水平;實驗方案②:SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，用100 nmol·L－1ET-1刺激，同時加入或不加 1 μmol·L－1ET-1 受體拮抗劑(endothelin A receptor，ETAR)(美國 Calbiochem 公司)，24 h 后收集細胞，檢測SLUG轉錄水平;實驗方案③:SK-OV-3和CaOV3種植在6孔板中無血清過夜后，轉染ROCK的顯性激活突變體后，分別在0，24，48，72 h收集細胞，檢測SLUG和E-cadherin的轉錄水平。

用TRIzol試劑(美國Gibco公司)提取細胞的總RNA?？俁NA用RNA逆轉錄酶(美國Invitrogen公司)逆轉錄，并在第1鏈CDNA中加入寡核苷酸引物。應用SYBR-Green的方法進行real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參照。PCR條件:95℃ 1 min，55℃ 1 min，and 72℃ 1 min，30個循環(huán)。引物序列如下:GAPDH:sense 5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3'Antisense5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3';SLUG:sense5'-TGATGAAGAGGAAAGACTACAG-3'antisense5'-GCTCACATATTCCTTGTCACAG-3';Snail:sense 5'-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3'antisense 5'-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3';TWIST:sense 5'-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3'Antisense 5'-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3';ROCK:sense 5'-GATGGATTGGATGCTTTGGTTTA-3'Antisense5'-GCTGAACAACCCAAGGACTA-3';E-cadherin:sense 5'-AGAATGACAACAAGCCCGAAT-3'antisense 5'-CGGCATTGTAGGTGTTCACA-3'。

1.6 報告基因分析 SK-OV-3和CaOV3種在6孔板中無血清過夜后，瞬時轉染1.5 μg含SLUG啟動子的pGL3 basic質(zhì)粒與15 ng Renilla質(zhì)粒(promega)。它們共轉染 ROCK的顯性激活突變體［7］(由美國賓西法尼亞大學生物工程系Chen CS教授惠贈)或者與ROCK抑制劑Y27632共同孵育。24 h后，使用熒光素酶報告檢測試劑盒 (美國Promega公司)檢測熒光素酶與Renilla的熒光值，用Luciferase熒光值/Renilla熒光值代表熒光素酶的活性。結果以±s表示，每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 ET-1誘導SK-OV-3和CaOV3細胞形態(tài)，βtubulin微管蛋白，以及EMT標志蛋白的變化 用100 nmol·L－1ET-1孵育 SK-OV-3和 CaOV3細胞24 h，共聚焦顯微鏡觀察胞質(zhì)中β-tubulin微管蛋白的變化。發(fā)現(xiàn)細胞失去上皮細胞的形態(tài)而變得有較長，較多的偽足，胞質(zhì)中β-tubulin微管蛋白(免疫熒光染色為綠色)被拉長，呈現(xiàn)為纖維細胞的表型(Fig 1A)。Boyden小室體外侵襲實驗表明暴露給ET-1增加了細胞的體外侵襲力(Fig 1B);給予100 nmol·L－1ET-1刺激SK-OV-3和CaOV3細胞24 h，發(fā)現(xiàn)ET-1處理后Fibronectin表達量增加，是對照組的3倍多;而E-cadherin的表達降低。這些結果表明ET-1刺激影響了SK-OV-3和CaOV3 EMT基因的表達變化以及EMT相關形態(tài)的改變(Fig 1C)。

2.2 ET-1促進SK-OV-3和CaOV3細胞轉錄因子SLUG的轉錄 在ET-1誘導SK-OV-3和CaOV3細胞EMT的同時，我們用實時定量PCR檢測E-cadherin的轉錄抑制因子如SLUG、Twist及Snail的表達變化。如Fig 2A和B，ET-1刺激24 h后，SLUG mRNA表達水平增加，但是Snail mRNA的水平?jīng)]有變化，而Twist mRNA水平下降。為了進一步證實ET-1對SLUG mRNA的表達影響，我們分析了給予100 nmol·L－1ET-1 處理細胞 3、6、12、24 h 不同時間點情況下，SLUG mRNA的表達。結果發(fā)現(xiàn)ET-1作用3 h后SLUG mRNA水平即開始增加，在24 h時達到了最高點。而且，ET-1誘導SLUG mRNA的增加可以完全被ETAR拮抗劑BQ123所阻斷(Fig 2C和D)。這些結果表明在E-cadherin 3個主要的轉錄抑制因子中，SLUG是唯一一個能被 ET-1/ETAR刺激信號上調(diào)的因子。

Fig 1 ET-1 induced morphologic and related gene changes of EMT in CaOV3 and SK-OV-3 cells

2.3 ET-1活化 ROCK 促進 SK-OV-3和 CaOV3細胞EMT 為探討ET-1是否通過活化ROCK促進SK-OV-3和CaOV3細胞EMT，我們用ET-1或ET-1聯(lián)合ROCK抑制劑Y27632或聯(lián)合使用ROCK的顯性激活突變體處理SK-OV-3和CaOV3細胞后檢測ROCK和間充質(zhì)標記基因Fibronectin蛋白表達。如Fig 3A和B所示，在未處理組細胞，ROCK和Fibronectin的蛋白表達水平較低，當ET-1處理后，ROCK和Fibronectin蛋白表達水平迅速升高;ROCK抑制劑Y27632能抑制ET-1對ROCK和Fibronectin蛋白表達的促進作用。而當ET-1與ROCK顯性激活突變體聯(lián)合使用時，ROCK和Fibronectin蛋白表達明顯增加;如Fig 3C所示，Boyden小室體外侵襲實驗表明:ET-1處理SK-OV-3和CaOV3細胞后，其侵襲力明顯增加，而ROCK的抑制劑Y27632能抑制其增加，轉染ROCK顯性激活突變體能促進ET-1誘導的侵襲力增加。這些結果表明，ET-1通過活化ROCK誘導SK-OV-3和CaOV3細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲力。

Fig 2 ET-1 increases the level of SLUG mRNA in SK-OV-3 and CaOV3 cells

2.4 ROCK上調(diào) SK-OV-3和 CaOV3細胞中SLUG的轉錄啟動子活性，促進SLUG轉錄，抑制E-cadherin轉錄 由于ROCK與上皮性腫瘤細胞的侵襲相關，我們假設ROCK可能在轉錄水平激活SLUG并抑制上皮細胞標志基因E-cadherin轉錄。如Fig 4A和B，實時定量PCR結果提示，ROCK顯性激活突變體轉染后24 h，SLUG mRNA水平增加，在轉染后48 h達到最高，同時E-cadherin mRNA減少;為確定SLUG是否為ROCK的下游靶基因，我們克隆SLUG啟動子序列到熒光素酶(luciferase)基因的上游。熒光素酶分析提示，ROCK激活引起SLUG啟動子活性增加2.5倍，ROCK抑制劑Y27632的明顯減少了SLUG啟動子活性(Fig 4C)。該結果表明，ROCK通過上調(diào)SLUG啟動子活性增加了SLUG的轉錄水平。

Fig 3 ET-1 induced EMT of CaOV3 and SK-OV-3 cells by active ROCK(±s，n=3)

3 討論

約80%的卵巢癌為上皮來源的，上皮性卵巢癌被認為是由正常卵巢上皮轉型而來，具有高度的侵襲和轉移能力。當上皮性腫瘤獲得侵襲表型即向間充質(zhì)細胞表型轉化，此病理過程稱為EMT。EMT促進了腫瘤細胞的運動和侵襲，是與腫瘤進展及轉移相關的重要細胞過程。

Fig 4 ROCK increases SLUG mRNA synthesis by up-regulation of SLUG promoter activity，and then inhibits E-cadherin mRNA in CaOV3 and SK-OV-3 cells(±s，n=3)

基于以下證據(jù)，本研究首次報道 ET-1活化ROCK/SLUG通路，誘導人卵巢癌細胞發(fā)生EMT。①ET-1與細胞ETAR結合，改變了許多關鍵基因的表達，包括下調(diào)上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達，上調(diào)間充質(zhì)細胞標志蛋白Fibronectin的表達，同時增強人卵巢癌細胞的侵襲力。②ET-1誘導了E-cadherin的主要抑制基因SLUG的轉錄和SLUG蛋白的表達;而且，ETAR拮抗劑BQ123消除了ET-1對SLUG的誘導作用。③ ET-1通過活化ROCK信號誘導人卵巢癌細胞EMT發(fā)生。因為轉染ROCK顯性激活突變體可與ET-1共同誘導EMT，反之，ROCK抑制劑Y27632，阻斷了ET-1對EMT的誘導作用。④ROCK通過上調(diào)SLUG基因轉錄啟動子活性促進SLUG基因的轉錄，同時抑制上皮細胞標志E-cadherin的轉錄。這些表明在ET-1誘導人卵巢癌細胞發(fā)生EMT過程中，SLUG是ROCK下游靶基因，ROCK/SLUG通路在ET-1誘導人卵巢癌細胞發(fā)生EMT中起重要作用。因為上皮性腫瘤進展的兩個基本特征是喪失正常上皮的結構以及和微環(huán)境的相互作用［3］，所以本研究闡明了ET-1是通過活化ROCK/SLUG信號通路，從而促進人卵巢癌細胞發(fā)生EMT以及惡性進展與轉移。

E-cadherin的功能缺失被認為是EMT的關鍵步驟。E-cadherin的缺失也導致上皮級性的完全喪失。E-cadherin的缺失可因基因突變，染色體缺失，蛋白酶的剪切或者上皮cadherin基因(epithelial cadherin gene，CDH1)啟動子的沉默而引起［8］。CDH1啟動子的沉默可因DNA高度的甲基化而引起或者轉錄因子如SLUG，Snail Twist與CDH1啟動子區(qū)的E-box結合而抑制 CDH1啟動子的活性［9－11］。SLUG、Snail為鋅指結合蛋白，屬于 Snail超家族成員［12］。在上皮細胞中外源性表達SLUG，Snail會引起EMT，表現(xiàn)為遷移和侵襲特征，此現(xiàn)象在卵巢癌中也觀察到［4］。本研究表明，ET-1誘導人卵巢癌細胞發(fā)生EMT時，伴有SLUG mRNA的上調(diào)，但是Snail mRNA的表達沒有變化。雖然兩個轉錄因子來自于相同的家族，但是可能會在不同的腫瘤環(huán)境和特殊的細胞類型中發(fā)揮不同的作用［9］。

Rho/ROCK信號通路涉及到多種癌細胞的運動和侵襲［13－14］，包括人卵巢癌細胞［15－16］。SLUG 可以抑制上皮細胞表型基因 Cadherin的表達［17］，促進間充質(zhì)細胞表型基因如 Fibronectin的表達［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，ET-1誘導 SLUG蛋白的表達可由ROCK抑制劑Y27632所逆轉，相反，ROCK的顯性激活突變體可與ET-1協(xié)同增加SLUG的表達，而且ROCK活化能上調(diào)SLUG基因的轉錄;本研究也觀察到ROCK抑制劑Y27632或ROCK的顯性激活突變體可以調(diào)節(jié)人卵巢癌細胞EMT相關蛋白如E-cadherin、Fibronectin的表達。

總之，本研究顯示，ET-1通過活化ROCK/SLUG信號通路，從而促進人卵巢癌細胞發(fā)生EMT，這表明抑制ROCK/SLUG活化，有可能逆轉人卵巢癌的侵襲與轉移。

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