P2X2/3受體在大鼠眶下神經(jīng)慢性壓迫性損傷中表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

趙莉莉，雷 潔，王元銀，，劉安東，解 敏，楊 晨，陳葉俊，孫 輝，周 健，王烈成，張志愿

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽省口腔疾病研究省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽合肥 230032;3.上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院，上海 200011)

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為三叉神經(jīng)根的脫髓鞘改變是三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)的病理基礎(chǔ)。三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)分布有P2X1-6等多種受體［1－2］，P2X2/3 受體高選擇性地表達(dá)于中、小直徑TG神經(jīng)元中，與痛覺傳遞密切相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄性損傷(chronic constriction injury to the infraorbital nerve，CCIION)模型，觀察其行為學(xué)改變及 TG神經(jīng)元中P2X2/3受體表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，以探討P2X2/3在CCI-ION所致的TN的TG神經(jīng)元過程中的變化規(guī)律，為TN的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)♂ SD大鼠85只，80～120 g。隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組(Ⅰ組)5只;手術(shù)組(右側(cè)為Ⅱ組，左側(cè)為Ⅲ組)和假手術(shù)組(Ⅳ組)術(shù)后每周各取5只作相應(yīng)的手術(shù)處理。

1.2 CCI-ION 模型建立 1.814 mol·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥位，消毒后作右側(cè)眉弓上弧形切口，暴露眶下神經(jīng)，兩根結(jié)扎線間距約2 mm結(jié)扎眶下神經(jīng)，Ⅳ組只暴露不結(jié)扎。

1.3 行為測(cè)試 將各組大鼠在術(shù)后每周行機(jī)械痛域測(cè)試，感覺測(cè)試儀由IITC Life Science公司提供，刺激部位為觸須部位及周圍有毛皮膚，輕觸甚至未有任何觸碰大鼠表現(xiàn)出明顯的退縮、攻擊或搔臉行為時(shí)記錄為痛域值，每只大鼠刺激5次取平均值。

1.4 HE和免疫組化 術(shù)后每周處死大鼠取TG，HE染色行形態(tài)學(xué)觀察，免疫組化方法檢測(cè)P2X2/3的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以±s表示，各組各時(shí)間點(diǎn)與Ⅰ組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)改變 模型組大鼠出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象，較Ⅰ組疼痛閾值明顯降低(P＜0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Changes of mechanical withdrawal threshold of ION-CCI rats in each group(n=5)

2.2 形態(tài)學(xué)改變 Ⅰ組:胞膜完整，胞核大小、形態(tài)正常，神經(jīng)纖維光滑連續(xù)、粗細(xì)均勻。Ⅱ組:細(xì)胞染色不均，髓鞘增粗，纖維迂曲腫脹斷裂(Fig 2)。

2.3 免疫組化染色 各組 TG中均能檢測(cè)出P2X2/3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞(Fig 3)。

Fig 2 Changes of the HE staining after the surgery in the control group and the CCI-ION surgery group

TG neuron，detected in middle and small diameter neurons A:P2X2 receptor;B:P2X3 receptor

2.3.1 P2X2/3表達(dá)陽性細(xì)胞率改變 鏡下行陽性細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，得出陽性細(xì)胞率。Ⅱ組P2X2/3陽性細(xì)胞率明顯提高，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上下波動(dòng)，但始終高于Ⅰ組水平(P＜0.01)。見Fig 4。

2.3.2 P2X2/3不同時(shí)間段的表達(dá)變化 用光學(xué)顯微鏡計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量背景灰度作P2X2/3的表達(dá)強(qiáng)度分析。Ⅱ組P2X2/3平均光密度一直明顯高于Ⅰ組(P＜0.05)。見Fig 5。

Fig 4 Changes of the rate of positive cell experssing P2X2/3 receptor in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

3 討論

ATP 與神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動(dòng)密切相關(guān)［4－5］，傷害性剌激使感覺神經(jīng)末梢本身釋放大量ATP激活P2X受體［6－7］，促進(jìn)谷氨酸釋放，誘發(fā)動(dòng)作電位產(chǎn)生疼痛感覺［8－9］。研究顯示P2X2/3受體參與多種疼痛產(chǎn)生的過程，P2X2主要介導(dǎo)急性神經(jīng)病理痛，而P2X3主要介導(dǎo)慢性神經(jīng)病理性痛的發(fā)生［10－11］。研究表明，CCI-ION模型可能損傷了包繞在神經(jīng)元外的星形膠質(zhì)細(xì)胞，釋放ATP，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的激活并誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)性痛［12－14］。

Fig 5 Changes of P2X2/3 receptor experssion in trigeminal ganglion of each group after CCI-ION(n=5)

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)P2X2/3受體表達(dá)情況的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ組P2X2/3的表達(dá)與其它各組相比呈上調(diào)趨勢(shì)，1W陽性細(xì)胞率明顯提高，推測(cè)可能是由于手術(shù)機(jī)械性損傷引起的代償反應(yīng);P2X2/3平均光密度值較其它各組各時(shí)間點(diǎn)也明顯增多，提示其與大鼠TN密切相關(guān)，介導(dǎo)了 TN的發(fā)生。Ⅳ組術(shù)后早期P2X2/3陽性細(xì)胞率及表達(dá)量較Ⅰ組均顯著提高，晚期則差異無顯著性，提示術(shù)后早期由于手術(shù)急性損傷造成急性期炎性反應(yīng)，之后隨著炎癥的消退和TG的自我修復(fù)而有所恢復(fù)。Ⅱ組P2X2受體平均光密度2周升高達(dá)高峰后逐漸降低，5周后又表現(xiàn)出升高后降低的變化趨勢(shì)提示P2X2可能與三叉神經(jīng)痛的陣發(fā)性發(fā)作特征有一定關(guān)系，主要參與急性痛或炎性痛。與Ⅳ組相比，Ⅲ組在術(shù)后早期P2X3受體陽性細(xì)胞率及表達(dá)量差異均無顯著性，而到晚期兩者均明顯高于Ⅳ組，并一直持續(xù)到觀察結(jié)束，可能是由于術(shù)后早期由于手術(shù)損傷引起對(duì)側(cè)繼發(fā)炎性反應(yīng)，后期手術(shù)側(cè)痛覺的神經(jīng)傳導(dǎo)對(duì)對(duì)側(cè)TG產(chǎn)生了影響，這與臨床上TN的發(fā)病特征有相似性，但具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，P2X2/3參與了TN的誘發(fā)、痛覺傳遞過程，其中P2X2主要參與急性痛或炎性痛，而P2X3對(duì)急性痛及痛疼的維持都起重要作用;而手術(shù)對(duì)側(cè)組P2X3表達(dá)量的變化說明手術(shù)側(cè)的痛覺神經(jīng)傳導(dǎo)對(duì)對(duì)側(cè)TG產(chǎn)生了影響。

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