二烯丙基二硫誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞分化的差異蛋白質(zhì)分析

劉 瑤，向姝霖，袁靜萍，3，何 潔，謝錦云，陳 平，梁宋平，蘇 琦

(1.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南衡陽(yáng) 421001;2.湖北省疾病預(yù)防控制中心食品藥品安全性評(píng)價(jià)研究所，湖北武漢 430079;3.武漢市中心醫(yī)院病理科，湖北武漢 430014;4.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410081)

胃癌是最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)生率與死亡率分別占全球惡性腫瘤的8%與10%，而我國(guó)胃癌死亡率為25.2/10萬(wàn)，占惡性腫瘤的23.2%，是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的4.2～8.0倍［1-2］。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜的一種脂溶性有效成分，對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和白血病等腫瘤均有明顯的抑制作用，是一種有開(kāi)發(fā)潛力的抗腫瘤藥物［3-6］。我們先前的研究證實(shí)，DADS可體內(nèi)外明顯抑制人胃癌細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)向正常細(xì)胞分化，但其分子機(jī)制尚未完全闡明［7］。本文研究DADS誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞分化過(guò)程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，進(jìn)一步尋找胃癌分化的相關(guān)蛋白質(zhì)及腫瘤相關(guān)標(biāo)記物，為胃癌的診斷和治療提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) MGC803細(xì)胞(山東師范大學(xué)生物系建株，為人胃低分化粘液腺癌，本實(shí)驗(yàn)室保存)用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 DADS為Fluka公司產(chǎn)品(d420=1.0，

Mr 146.28);小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;二硫蘇糖醇、尿素、CHAPS、固相pH梯度干膠條(IPG strip pH 3～10，18 cm)、IPG 緩沖液(pH 3 ～10)、覆蓋液、蛋白銀染試劑盒、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自Amersham Biosciences公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸、硫代硫酸鈉、碳酸氫氨、胰蛋白酶、PMSF、甘油等購(gòu)自上海生工;乙腈為國(guó)產(chǎn)色譜純;TPCK處理的胰蛋白酶、基質(zhì)α-羥基肉桂酸、碘乙酰胺、三氟乙酸、鐵氰化鉀等購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 儀器 IPGphor等電聚焦儀為Pharmacia公司產(chǎn)品;Voyager-DETM STR-MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀為Applied Biosystem公司產(chǎn)品;垂直電泳儀、PDQuest軟件為Bio-Rad公司產(chǎn)品;Speedvac公司的冷凍干燥離心機(jī);Sigma公司的超速低溫離心機(jī);清華紫光的凝膠掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞總蛋白的制備 30 mg·L-1的DADS處理24 h后，4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，吸凈PBS，加入細(xì)胞裂解液(8 mol·L-1urea+4%CHAPS+40 mmol·L-1Tris+1%DTT+1 mmol·L-1PMSF+0.5%IPG buffer pH 3～10)冰盒上4℃靜置30 min，用細(xì)胞刮匙刮取并收集裂解液，15 000 r·min-14℃離心15 min，取少量上清液用Bradford法測(cè)定總蛋白質(zhì)的濃度，其余上清液置-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 第一向固相pH梯度等電聚焦 將含細(xì)胞總蛋白200 μg提取液與水化液(8 mol·L-1urea+4%CHAPS+18 mmol·L-1DTT+0.5%IPG buffer pH 3～10+痕量溴酚藍(lán))充分混合，以總體積350 μl加入IPG膠槽。將IPG干膠條去保護(hù)膜后膠面朝下，置入膠槽中，驅(qū)除氣泡，并覆蓋一層石蠟油，置于IPGphor等電聚焦儀的電極板上，水化和聚焦在20℃自動(dòng)進(jìn)行，總電壓為37 920 Vh，其中在30 V水化 14 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 4 h 30 min。等電聚焦結(jié)束后立即取出IPG膠條分別于20 ml平衡液 A(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8+6 mol·L-1urea+30%甘油+1%SDS+0.2%DTT)和20 ml平衡液B(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8+6 mol·L-1urea+30%甘油+1%SDS+3%碘乙酰胺+痕量溴酚藍(lán))中各平衡15 min。

1.2.3 第二向垂直SDS-PAGE電泳 在灌好的SDS-PAGE膠面上加入1%的瓊脂糖，然后將平衡后的膠條面朝外轉(zhuǎn)移至膠的頂部，并且避免氣泡產(chǎn)生，在膠的一端放入吸有低分子量Marker的濾紙片，安裝好電泳槽后先用250 V 25mA電泳，待溴酚藍(lán)遷移至濃縮膠(4.8%)和分離膠(12.5%)的界面時(shí)，換用500 V 50mA電泳至溴酚藍(lán)前端到達(dá)底部約1 cm處停止電泳。整個(gè)過(guò)程用12℃循環(huán)水冷卻。

1.2.4 蛋白質(zhì)銀染 按照蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行適當(dāng)修改，依次經(jīng)過(guò)固定(40%乙醇+10%冰乙酸)30 min;敏化(30%乙醇+0.2%硫代硫酸鈉+6.8%乙酸鈉);洗滌3次，每次5 min;銀染(0.25%硝酸銀)20 min;洗滌2次，每次1 min;顯影(2.5%碳酸鈉+0.0074%甲醛)2～5 min至斑點(diǎn)清晰為止;最后加入1.46%EDTA-Na2·H2O終止10 min。凝膠經(jīng)掃描后用保鮮膜4℃保存。

1.2.5 凝膠圖像分析 將經(jīng)過(guò)銀染的凝膠通過(guò)掃描成像，用PDQuest軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、斑點(diǎn)匹配、量化等分析。

1.2.6 質(zhì)譜樣品的制備 在凝膠上選取重復(fù)性好、邊界清楚的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，切割后放入1.5 ml的Eppendorf管中用100 mmol·L-1硫代硫酸鈉和30 mmol·L-1鐵氰化鉀(1 ∶1)脫色，100 mmol·L-1的碳酸氫銨+10 mmol·L-1的DTT于57℃還原1 h，再用100 mmol·L-1的碳酸氫銨 +55 mmol·L-1碘乙酰胺烷基化30 min，用 TPCK-處理的胰蛋白酶(100 g/700 L)37℃ 酶解 28 h，加入 100 μl 0.1%TFA震蕩混勻，12 000 r·min-1離心5 min，取上清用Millipore公司的ZipTipTMC18微柱進(jìn)行脫鹽，與飽和的CCA基質(zhì)液混合，點(diǎn)樣于不銹鋼點(diǎn)樣板上，空氣中自然干燥后準(zhǔn)備上質(zhì)譜分析。

1.2.7 質(zhì)譜分析 樣品置Voyager-DETMSTR-MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀上分析，采用線性模式，正離子譜測(cè)定，離子源加速電壓1為20 kV，加速電壓2為18.85 kV，N2激光波長(zhǎng)為337 nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100 ns，真空度4×10-7Torr，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，并用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動(dòng)降解離子峰作為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰，獲得肽質(zhì)量指紋圖。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 將獲得的肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)通過(guò) MS-FIT軟件上 http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/masfit.htm、http://www.expasy.ch及http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進(jìn)行查詢。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Student T-test法進(jìn)行分析，數(shù)值用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 DADS處理MGC803細(xì)胞總蛋白質(zhì)的雙向電泳銀染圖譜 Fig 1是DADS處理MGC803細(xì)胞前后的總蛋白質(zhì)的雙向電泳銀染圖譜。經(jīng)掃描成像及PDQuest軟件分析，對(duì)照組與處理組蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為(576±14)個(gè)與(583±4)個(gè)。蛋白質(zhì)點(diǎn)與參考膠的匹配結(jié)果，對(duì)照組與處理組平均匹配點(diǎn)分別為(434±24)個(gè)與(413±8)個(gè)(n=3)，其平均匹配率分別為76%和70%。

Fig 1 Images of 2DE of MGC803 cells proteome treated with DADS stained by silver

2.2 DADS處理MGC803細(xì)胞總蛋白質(zhì)的雙向電泳銀染圖譜的差異點(diǎn)分析 經(jīng)PDQuest軟件進(jìn)行匹配分析，在兩組圖譜中有421個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配，有200個(gè)點(diǎn)未匹配，其中與對(duì)照組相比相差2倍以上的有291個(gè)，相差10倍以上的有61個(gè)(Fig 2)。

Tab 1 Upregulated proteins of differentiation in MGC803 cells induced by DADS

Tab 2 Downregulated proteins of differentiation in MGC803 cells induced by DADS

Fig 2 Matching spots in treated and untreated MGC803 cells by DADS

2.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的原位酶解和質(zhì)譜分析 從PDQuest軟件分析的差異點(diǎn)中選取部分重復(fù)性好、界限清楚的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行原位酶解后上質(zhì)譜測(cè)定其肽質(zhì)量指紋圖譜，并經(jīng)MS-FIT軟件搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，初步鑒定結(jié)果有24個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(Fig 3、4，Tab 1、2)。

Fig 3 Distribution of 24 disparate points analyzed by PDQuest software

3 討論

我們已證實(shí)，DADS可抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)ALP比活性與Con A凝集率下降，細(xì)胞骨架蛋白合成增加與重組，細(xì)胞GJIC恢復(fù)，細(xì)胞異型性下降，表面微絨毛減少，核變小，核漿比降低，常染色質(zhì)增加，異染色質(zhì)減少，具有向正常細(xì)胞分化傾向。機(jī)制與 G2/M阻滯，調(diào)節(jié) ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1、激活p38、抑制 ERK/AP-1通路，上調(diào)組蛋白乙?；21 WAF1等有關(guān)［7-10］。

Fig 4 Peptide mass fingerprinting of differential expression proteins

采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是尋找疾病相關(guān)蛋白質(zhì)、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志分子的有效途徑。本研究在DADS誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞分化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)24個(gè)與細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞免疫及代謝等相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中，gastric mucin、nM23、RORα、MHC DR-beta-1 chain、TCR 等上調(diào)，CDC2、uPAR、LIMK等下調(diào)。

CDC2(CDK1)是一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶，CDK1與Cyclin B1復(fù)合物的活化是G2期進(jìn)入M期的必要條件。我們已經(jīng)證實(shí)，DADS阻滯MGC803細(xì)胞在G2/M期與影響CDK1/cyclin B1復(fù)合物形成有關(guān)［8，10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) DADS 處理的MGC803細(xì)胞CDC2表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論。

胃粘膜蛋白MUC5AC是胃粘膜上皮分化的重要標(biāo)志。研究證明，MUC5AC在正常胃粘膜高表達(dá)，而胃癌表達(dá)降低，且與侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示MUC5AC可作為胃癌進(jìn)展的重要預(yù)后參數(shù)［11］。本研究顯示，DADS可上調(diào)MGC803細(xì)胞胃粘液蛋白，表明DADS可誘導(dǎo)胃低分化粘液癌細(xì)胞向正常胃粘膜分化。

nM23是一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移因子。大量研究表明nM23表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、分級(jí)、預(yù)后等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)DADS處理的nM23蛋白表達(dá)上調(diào)，胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性下降。

RORα是核受體超家族中的一員，廣泛分布于機(jī)體各組織，具有多種重要的生理功能。近年來(lái)，RORα在腫瘤中的作用成為研究的熱點(diǎn)之一。本研究顯示，DADS可上調(diào)RORα。研究表明，nm23等基因的啟動(dòng)子存在RORα反應(yīng)元件，RORα磷酸化可通過(guò)削弱Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，發(fā)揮抑制腫瘤作用。因此，RORα具有重要的抗腫瘤作用，是腫瘤治療的一個(gè)可能的潛在靶點(diǎn)［12］。

uPAR是一種糖基磷脂酰肌醇錨定的蛋白質(zhì)，與uPA結(jié)合可調(diào)控ECM蛋白水解，活化Src、FAK、Rac、ERK/MAPK和JAK/STAT等信號(hào)途徑，在細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要作用。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)uPAR在腫瘤趨向性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變與胞葬作用等具有新功能，并可能成為治療腫瘤的靶點(diǎn)［13］。本研究顯示DADS可下調(diào)uPAR，推測(cè)DADS可能通過(guò)減少uPAR表達(dá)而抑制胃癌的遷移與侵襲。

LIMK家族主要有LIMK1和LIMK2，在腫瘤遷移侵襲過(guò)程中起著非常重要的作用。LIMK1可通過(guò)Rho-ROCK1/PAK1-LIMK1-Cofilin通路，影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞形態(tài)、黏附與侵襲轉(zhuǎn)移。LIMK1在許多腫瘤組織中高表達(dá)并參與腫瘤生長(zhǎng)、血管形成及遷移侵襲過(guò)程［14］。本研究顯示，DADS能下調(diào)MGC803細(xì)胞LIMK，可能與抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們已證明，DADS可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲與下調(diào) LIMK1有關(guān)［15］。

在免疫應(yīng)答過(guò)程中，由MHC-抗原肽-TCR三分子復(fù)合物傳遞抗原信息，啟動(dòng)T細(xì)胞激活和免疫應(yīng)答，MHC是TCR的配體。Toll/Interleukin-1 receptor-like3(TLR3)可通過(guò)激活NF-kappaB參與免疫調(diào)節(jié)。本研究顯示，DADS可上調(diào)MGC803細(xì)胞HLADR-beta-1與TCR，下調(diào) TLR 3，表明 DADS可能通過(guò)增強(qiáng)免疫效應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

此外，本研究在DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化中還發(fā)現(xiàn)下調(diào)CA antigen NY-CO-45、Dnmlp/Vpsiplike protein、h-neuro-d4 protein、phosphodiesterase、KIAA0692 protein、transcobalamin Ⅱ、HnRNP F protein、NF-AT3及一種未知蛋白，上調(diào)X-linked inhibitor of apotosis、proteinkinase、Malate dehydrogenase precursor、Kruppel-related zinc finger protein、Snake venomlike protease與endothelial cell protein C/APC receptor等16個(gè)蛋白，作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化中有許多不同功能的蛋白質(zhì)從多種途徑參與了這一過(guò)程。尚需進(jìn)一步對(duì)其它差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定與確證，以篩選并獲得與胃癌分化相關(guān)的分子標(biāo)志物，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相關(guān)標(biāo)記物以及胃癌的診斷和治療提供靶點(diǎn)。

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