黃芪注射液對腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK-3表達的影響

劉莎莎，高維娟，錢 濤，張 霞

(1.承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北承德 067000;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院，河北石家莊 050026)

缺血性腦血管疾病是臨床常見且嚴重威脅人類健康的一類疾病，其中腦缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是缺血性腦血管病發(fā)病的重要病理生理過程。在缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡是神經(jīng)元損傷的發(fā)生機制之一，其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)信號通路在腦缺血/再灌注損傷過程中尤其是程序性細胞死亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［1］。黃芪注射液(astragalus injection)為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細胞凋亡的發(fā)生［2］。本課題組前期實驗也證實黃芪注射液可抑制全腦缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，并且對離體培養(yǎng)的缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有抑制作用［3］，但黃芪注射液是否通過抑制JNK信號通路上的關(guān)鍵激酶JNK3而起作用，尚未見報道。本研究通過建立全腦缺血/再灌注大鼠模型觀察黃芪注射液對腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白及其mRNA表達的影響，探討黃芪注射液抑制細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康♂ SD大鼠258只，體重(220～280)g，由天津山川紅實驗動物科技有限公司提供，許可證號:SCXK(津)2009-0001。

1.2 試劑和儀器 兔抗大鼠JNK3多克隆抗體購自美國Bioworld公司;兔抗大鼠JNK3單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司;小鼠抗大鼠β-actin購自美國Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司;JNK3引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司設計合成;TRIzol購自美國Invitrogen公司;RTPCR試劑盒購自大連寶生物公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，20 ml/支(每1 ml相當于 2 g生藥)，生產(chǎn)批號:國藥準字Z51021776;其它試劑為國產(chǎn)分析純。TDL-40B離心機:上海安亭科學儀器制造廠產(chǎn)品;DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠產(chǎn)品;光學顯微鏡:日本OLYMPUS公司生產(chǎn);石蠟切片機:德國LEICA公司生產(chǎn)。

1.3 實驗分組 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組:假手術(shù)組、模型組、黃芪注射液組和黃芪注射液溶劑對照組，各組根據(jù)再灌注后不同時間點再分為0、0.5、2、6、24、72 h 和120 h 7 個亞組，每個亞組12只動物。

1.4 模型制備 采用改良的Pulsinelli’s 4VO(four vessel occlusion，4vo)法制備腦缺血/再灌注動物模型:大鼠于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于固定臺上，在枕骨后切開皮膚，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動脈，造成永久性閉塞，縫合切口。24 h后將大鼠乙醚麻醉，仰臥固定，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，以“4”號絲線穿線備用，待大鼠清醒后用微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈造成腦缺血，30 min后松開微動脈夾恢復血流，縫合切口。模型成功標準為:雙側(cè)頸總動脈夾閉后1 min內(nèi)動物意識喪失;眼球變白，雙側(cè)瞳孔散大，對光反射消失;翻正反射消失。凡不符合上述標準者或再灌注期間出現(xiàn)全身強直、抽搐等異常反應或死亡者都被視作不成功。假手術(shù)組只做皮膚切口和組織分離。黃芪注射液組缺血前30 min腹腔注射黃芪注射液［12 g(生藥)·kg－1］，其中 24、72、120 h 組手術(shù)后每隔24 h追加給藥1次，以確保穩(wěn)定的血藥濃度。黃芪注射液溶劑對照組腹腔注射與黃芪注射液等量的無菌去離子水。

1.5 標本制備 于再灌注后的相應時點從每組大鼠中隨機選取6只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織，自動脫水機脫水，石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續(xù)切片;其余各組大鼠4%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速斷頭處死，在低溫修塊臺上分離出雙側(cè)海馬組織，置于Eppendorf管中，－80℃保存，備用。

1.6 HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理學改變

腦缺血/再灌注后120 h從各組大鼠中取6只大鼠的海馬組織切片進行HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理學改變。

1.7 免疫組化法檢測海馬組織JNK3的表達 從每組大鼠中取6只大鼠的海馬組織切片，采用SP法檢測JNK3的表達，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。兔抗大鼠JNK3多克隆抗體按1∶75稀釋;PBS代替一抗作陰性對照。選用Med6.0軟件測定陽性反應物灰度值:在切片的海馬CA1區(qū)各選取3個測量點，首先測定各點的顆粒細胞層灰度值，再用該測量值減去相應的背底灰度值后求平均值，即為大鼠海馬CA1區(qū)JNK3表達的免疫反應灰度值。

1.8 Western blot法檢測海馬組織JNK3蛋白表達 從每組取6只大鼠的海馬組織(－80℃保存)，提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，取25 μg樣品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉過夜，兔抗大鼠JNK3單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育2 h。山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，4℃搖床孵育1 h。洗膜后，采用化學發(fā)光法顯色，用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析。

1.9 RT-PCR法檢測海馬組織JNK3 mRNA的表達 從每組取6只大鼠的海馬組織(－80℃保存)，用TRIzol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV)說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照GAPDH引物序列上游 5'-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3'，下游5'-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3'，擴增片段長度為134 bp，JNK3引物序列上游5'-CGGATTCCGAGCACAATAAAC-3'，下 游 5'-AGGGTCGTACCAAACGTTGATGT-3'，擴增片段長度為137 bp。擴增條件:95℃預變性3 min;94℃ 30 s;56℃ 30 s;72℃ 40 s，循環(huán)30次;最后于72℃延伸3 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實驗重復6次。用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理學改變HE染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組組織形態(tài)無異常改變，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，均勻，細胞結(jié)構(gòu)完整;而模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯的病理改變，鏡下可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，界限不清楚，正常細胞結(jié)構(gòu)消失，固縮成三角形或不規(guī)則型;與模型組相比，黃芪注射液組病理變化得到一定程度的改善，海馬神經(jīng)元排列較整齊，細胞結(jié)構(gòu)較完整，而黃芪注射液溶劑對照組則無明顯改變，見Fig 1。

Fig 1 Pathological changes in hippocampus CA1 zone of rats 120 h after cerebral ischemia reperfusion in different groups(×400)

Fig 2 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(×400)

2.2 免疫組化法檢測海馬組織JNK3蛋白表達免疫組化染色結(jié)果:陽性反應為胞質(zhì)黃染，胞核內(nèi)有少許棕黃色顆粒。與假手術(shù)組比，模型組于再灌注0、0.5、2、6、24 h 和72 h JNK3 的表達均明顯增高(P＜0.05)，120 h組與假手術(shù)組比差異無顯著性(P＞0.05);與模型組比，除120 h外，黃芪注射液組各時間點JNK3的表達均降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組無差異(P＞0.05)，見Fig 2、Fig 3。

2.3 黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示:除120 h外，與假手術(shù)組比模型組各時間點JNK3蛋白表達平均灰度值均增高(P＜0.05);與模型組比，黃芪注射液組除120 h外的各時間點JNK3蛋白表達灰度值均降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組則無差異(P＞0.05)，見Fig 4、5。

Fig 3 Effect of astragalus injection on surface density value of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

Fig 4 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats

Fig 5 Effect of astragalus injection on mean optic density of JNK3 protein in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

2.4 黃芪注射液對腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示:JNK3 mRNA表達同JNK3蛋白表達趨勢相一致，見Fig 6、7。

3 討論

腦缺血后恢復腦血流是治療腦缺血最關(guān)鍵的方法，但再灌注后可加重缺血腦組織的損傷，而這種損傷以細胞凋亡為主。王鳳章等報道［4－5］，細胞凋亡是顳葉CA1區(qū)神經(jīng)細胞缺血/再灌注后的主要死亡形式。細胞凋亡的發(fā)生需要一個把細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞核內(nèi)部的傳遞者，而JNK信號轉(zhuǎn)導通路在這一過程中發(fā)揮著重要的作用［6］。

Fig 6 Effect of astragalus injection on expression of JNK3 mRNA in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats

c-jun氨基末端激酶(JNKs)家族是MAPKs家族成員之一，屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在脊椎動物，有3種編碼JNK的基因jnk-1、jnk-2和 jnk-3［7］，其相應的編碼產(chǎn)物 JNK1和 JNK2在各種組織細胞中廣泛表達，而JNK3則主要表達于腦組織［8］。在鈣離子超載、氧自由基等應激刺激下，位于胞質(zhì)中的JNK3被激活后迅速轉(zhuǎn)位入胞核，調(diào)節(jié)c-jun等凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。JNK可調(diào)控ATF2內(nèi)在的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性和泛素介導的AP-1蛋白降解，提高轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性［9］，從而引發(fā)JNK下游底物caspase等的凋亡級聯(lián)反應。

Fig 7 Effect of astragalus injection on mean optic density of JNK3 mRNA in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=6)

黃芪是中醫(yī)治療腦血管病的常用藥物，藥理學研究表明黃芪能明顯提高腦缺血/再灌注大鼠腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)和一氧化氮(NO)含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注等，從而有效對抗腦缺血/再灌注損傷［10］。黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、通脈養(yǎng)心、健脾利濕等功效。賴真等［11］研究表明黃芪注射液能減少大鼠腦缺血/再灌注后的神經(jīng)元凋亡。

本實驗采用4VO法建立腦缺血/再灌注大鼠模型，HE染色觀察海馬組織病理學改變，并分別從蛋白和基因水平觀察黃芪注射液對腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3表達的影響。實驗結(jié)果顯示:腦缺血/再灌注后120 h模型組出現(xiàn)明顯的病理改變，表明4VO法可成功模擬腦缺血/再灌注損傷。免疫組化結(jié)果顯示:假手術(shù)組可見JNK3輕度表達，且主要位于胞質(zhì)，而模型組可在胞質(zhì)及胞核內(nèi)同時發(fā)現(xiàn)JNK3陽性產(chǎn)物的表達，提示腦缺血/再灌注后，激活的JNK3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進而通過激活一系列下游轉(zhuǎn)錄因子介導神經(jīng)元凋亡。黃芪注射液可明顯降低腦缺血再灌注后 0、0.5、2、6、24 h和 72 h各時間點JNK3蛋白及mRNA的表達，表明黃芪注射液可抑制腦缺血/再灌注大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達，從而減少JNK3蛋白表達，從而抑制神經(jīng)元凋亡，這可能是其對腦缺血/再灌注損傷起保護作用的分子機制之一。實驗發(fā)現(xiàn)腦缺血/再灌注120 h組JNK3的表達與假手術(shù)組比差異無顯著性，說明黃芪注射液在腦損傷的早期用藥療效較好。

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