新型金屬銅絡合物對SMMC-7721細胞增殖與凋亡的影響

張 艷，韓鵬黎，徐 霞，程旭芳，王 寧，戈士文

(1.河南省醫(yī)藥科學研究院，2.鄭州大學藥學院，3.河南省肝病藥理重點實驗室，河南鄭州 450052)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年增長，已超過每年626萬人，居于惡性腫瘤的第5位;每年死亡人數(shù)接近60萬，位居腫瘤相關死亡的第 3位［1］。我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，目前發(fā)病人數(shù)約占全球的55%，在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二?，F(xiàn)在臨床上使用的化療藥物療效均不理想，因此尋找高效低毒的抗肝癌藥物迫在眉睫。

新型金屬銅絡合物(N-Cu)是由鄭州大學化學系無機教研室合成的，它是以抗高血壓藥替米沙坦為配體，8個銅整合在一起的相對分子質量為8 723的大分子化合物。已有的試驗資料顯示［2－3］N-Cu對小鼠S180和H22均具有明顯的抑制作用且毒性較低。本研究探討N-Cu在體外對人肝癌SMMC-7721細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用，為進一步開發(fā)NCu成為抗肝癌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品和試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購自Solarbio公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;DMSO和四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Solarbio公司;順鉑注射液(DDP)，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號:20091205;Annexin-Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司;TRIzol購于英俊公司;RT-PCR試劑盒購于寶生物公司;PCR引物由寶生物公司合成;Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin 抗體、山羊抗兔 I gG 均購于博奧森公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機(Biometra WT 16);PCR擴增儀(Biometra);酶標儀(Bio-Rad公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(KODAK GEL-100);核酸蛋白分析儀(Eppendorf公司);DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);垂直電泳系統(tǒng)和電轉系統(tǒng)(Bio-Rad公司170-3940);流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.4 MTT法檢測細胞生長抑制率 取對數(shù)生長期的細胞，調整細胞密度為5×107·L－1，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，培養(yǎng) 2 4 h后實驗組分別加0.3、1.5、3、6、12、24 μmol·L－1N-Cu，每個濃度均設5個復孔。同時設空白組、陰性對照組和陽性對照組(16.7 μmol·L－1DDP)。培養(yǎng) 2 4 h、48 h 和 7 2 h 后，每孔加入 M TT(5 g·L－1)溶液 2 0 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，加入DMSO 150 μl/孔，震蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測570 nm波長下各孔的吸光度(A)值，按以下公式計算細胞的生長抑制率。

細胞生長抑制率/%=(1－實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.5 碘化丙啶PI單染法檢測細胞周期 取對數(shù)生長期細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h 后實驗組分別加入 1 .5、3、6、12 μmol·L－1N-Cu，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細胞。用PBS液洗滌細胞2次，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清液。加入預冷的70% 乙醇溶液固定，于4℃下保存過夜。用流式細胞儀分析，按Cell Quest軟件檢測并分析細胞周期分布的情況。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡

實驗分組與“1.5”節(jié)相同，培養(yǎng)48 h后收集細胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，于1 h內上流式細胞儀用Cell Quest軟件檢測并分析細胞凋亡和死亡的情況。結果判斷:FITC－/PI－為活細胞，F(xiàn)ITC－/PI+為壞死細胞，F(xiàn)ITC+/PI－為凋亡細胞，F(xiàn)ITC+/PI+為凋亡后繼發(fā)死亡的細胞。按以下公式計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率/%=(凋亡細胞數(shù)+繼發(fā)死亡細胞數(shù))/全部細胞數(shù)×100%。

1.7 RT-PCR 法檢測細胞中 Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表達 取對數(shù)生長期細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后實驗組分別加入1.5、3、6 μmol·L－1N-Cu，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細胞，用4℃預冷的PBS緩沖液洗滌細胞兩次，棄上清液，加入TRIzol提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應。引物設計(見Tab 1)。PCR反應條件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，62℃ 40 s，72℃ 1 min，循環(huán)30 次，最后延伸72℃ 7 min，終止于4℃。于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外透射分析儀觀察結果，并通過凝膠圖像密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以GAPDH的表達量為對照計算各組Bcl-2、Bax、Caspase-3的相對表達量。

Tab 1 RT-PCR primer sequences and fragment

1.8 Western blot 檢 測 細 胞 中 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達 實驗分組與“1.7”節(jié)相同，提取藥物作用48 h的 SMMC-7721細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白含量。取蛋白30 μg作 SDSPAGE電泳，將蛋白樣本轉移至NC膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，分別加入抗Bcl-2多克隆抗體(1∶300)，抗 Bax多克隆抗體(1∶300)，抗Caspase-3多克隆抗體(1 ∶300)，4℃過夜。分別加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)，脫色搖床搖1 h，TBST洗3次，每次10 min。以β-actin作為內參。凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，并通過凝膠圖像密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以β-actin的表達量為對照計算各組 Bcl-2、Bax、Caspase-3的相對表達量。

2 結果

2.1 N-Cu 對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用N-Cu能有效抑制SMMC-7721細胞增殖，作用24 h、48 h、72 h后對細胞的生長有明顯的抑制作用，IC50值分別為 1 1.64、7.68、3.42 μmol·L－1，0.3 ～ 24 μmol·L－1表現(xiàn)出呈明顯的劑量和時間依賴效應，其中24 μmol·L－1N-Cu作用72 h后的抑制率高達(100.2 ±0.659)%。16.7 μmol·L－1DDP 的抑制率為98.14%。見Tab 2。

Tab 2 Inhibitory effect of N-Cu in SMMC-7721 cells by MTT(±s，n=3)

Tab 2 Inhibitory effect of N-Cu in SMMC-7721 cells by MTT(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control group(untreated with N-Cu)

N-Cu/μmol·L －1 Inhibitory rate/%24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 0.3 12.13 ±0.468* 22.32 ±0.499* 29.78 ±2.41*1.5 20.84 ±0.376* 28.40 ±0.338* 37.94 ±1.06*3 22.43 ±2.26* 38.99 ±1.91* 51.40 ±1.65*6 32.69 ±0.954* 46.25 ±3.16* 64.50 ±0.305*12 46.99 ±0.804* 67.93 ±1.30* 93.93 ±2.21*24 91.25 ±3.48* 98.31 ±0.367* 100.2 ±0.659*

2.2 N-Cu對SMMC-7721細胞周期及凋亡的影響PI單染法檢測結果顯示，對照組處于G0/G1期的細胞比率為(34.2±2.51)%，1.5、3、6、12 μmol·L－1N-Cu作用細胞48 h后，隨著藥物濃度的逐漸增加，G0/G1期的細胞比率逐漸上升，G2/M期和S期細胞比率逐漸下降;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測結果顯示，對照組細胞凋亡率為(7.85±0.41)%，經N-Cu處理48 h后，細胞凋亡率明顯增加。見 Fig 1，Tab 3。

2.3 N-Cu 對 SMMC-7721 細 胞 中 Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表達的影響 經凝膠成像系統(tǒng)光密度掃描發(fā)現(xiàn):N-Cu處理組與對照組相比，Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達增加，而 Bcl-2 mRNA和蛋白的表達減少。采用ImageJ軟件對各目的條帶與內參條帶進行灰度比較，以此比值為縱坐標作柱狀圖(Fig 2、3)，各組間差異具有統(tǒng)計學意義，Bcl-2 mRNA和蛋白的表達隨N-Cu濃度增加而降低，Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達均隨NCu濃度增加而升高。

Fig 1 Effects of N-Cu on cell cycle analysis and apoptosis of SMMC-7721 cell

Tab 3 Effects of N-Cu on cell cycle analysis and apoptosis of SMMC-7721 cells(%，±s，n=3)

Tab 3 Effects of N-Cu on cell cycle analysis and apoptosis of SMMC-7721 cells(%，±s，n=3)

*P＜0.05 vs control group(untreated with N-Cu)

N-Cu/μmol·L －1 G0/G1 S G2/M Apoptotic rate 0 34.2 ±2.51 8.8 ±1.95 56.5 ±2.35 7.85 ±0.41 1.5 69.5 ±2.45* 14.4 ±1.28* 16.2 ±1.97* 7.51 ±0.72 3 72.5 ±3.26* 16.9 ±2.36* 10.6 ±1.16* 8.97 ±0.35 6 79.7 ±2.34* 10.2 ±1.63 10.1 ±1.23* 15.15 ±1.46*12 90.6 ±1.94* 2.5 ±0.56* 6.9 ±1.61* 39.13 ±1.00*

Fig 2 Effects of N-Cu on expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA in SMMC-7721 cells

3 討論

金屬絡合物在疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用，最早的有關金屬絡合物抗腫瘤活性的報道可以追溯到16世紀，但直到20世紀60年代無機金屬絡合物順鉑的抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)后，金屬絡合物的抗腫瘤作用才引起了人們的高度重視。順鉑的發(fā)現(xiàn)和被作為抗腫瘤藥物的開發(fā)和利用，使無機金屬絡合物有望成為新一類抗腫瘤化療藥物。本實驗所用的N-Cu為新合成的物質，初步的藥效學和毒性試驗已證明其具有較好的抗腫瘤活性和較低的毒性。

近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期調控異常與腫瘤密切相關［4］。細胞增殖是通過細胞周期的運轉來實現(xiàn)的。本試驗結果顯示0.3～24 μmol·L－1N-Cu對SMMC-7721細胞具有明顯的增殖抑制作用，且呈明顯的時間和劑量依賴效應，IC50為 3.42 μmol·L－1，因此本實驗選擇 1.5、3、6 μmol·L－1的 N-Cu 研究其作用機制。隨著N-Cu濃度的增加，G0/G1期的細胞比率上升，提示N-Cu抑制細胞的增殖可能與其阻滯細胞從G0/G1期向S期的轉變有關，使細胞不能進入S期進行DNA的合成，最終導致生長抑制。

細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。本試驗結果顯示隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡的比率逐漸上升且呈明顯的劑量效應關系，提示誘導凋亡可能是N-Cu抗腫瘤作用的機制之一。

Fig 3 Effects of N-Cu on expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 proteins in SMMC-7721 cells

凋亡的發(fā)生途徑分為死亡受體依賴途徑和線粒體依賴途徑。在線粒體依賴途徑中，Bcl-2家族是重要的調控者［5－6］。Bcl-2 家族包括抑凋亡基因如Bcl-2和促凋亡基因如Bax。Bcl-2和Bax均通過調控內質網Ca2+參與的核內外物質轉運及膜通透性轉換來控制細胞色素C從線粒體中釋放，進而阻滯或誘導凋亡，Bcl-2與Bax的比值可以決定細胞是否發(fā)生凋亡［7］。Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起著重要的作用［8］。當接收到細胞凋亡信號的刺激，Bcl-2與Bax的比值變小，使線粒體外膜通透性升高，引起細胞色素C釋放到胞質中，激活 Apaf-1，與 Caspase-9前體結合激活Caspase-9，活化Caspase-3啟動凋亡。本實驗結果表明N-Cu誘導細胞凋亡的作用可能與改變Bcl-2/Bax的比值、啟動Caspase級聯(lián)反應相關。

本研究證實，N-Cu有抑制SMMC-7721細胞增殖的作用，阻滯細胞周期于G0/G1，并可通過上調細胞Bax、Caspase-3的表達，降低 Bcl-2/Bax比值，誘導其凋亡，是一種具有潛在抗肝癌作用的化合物。

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