諾美孕酮促進大鼠子宮內(nèi)膜異位癥細胞凋亡及其作用機制

郝樹芳，周嫻穎，謝淑武，周潔蕓，郭湘潔，李 釗，桂幼倫，朱偉杰，朱 焰

(1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632;2.上海市計劃生育科學(xué)研究所，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室生殖藥理組，上海 200032;3.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆粘膜以外的身體其他部位所造成的一種疾病，它是當(dāng)今國內(nèi)外婦產(chǎn)科的多發(fā)病和常見?。?］。該病導(dǎo)致的疼痛和不孕，嚴重困擾著患者的健康和生活質(zhì)量。諾美孕酮(nomegestrol acetate，NOMAc)是第4代孕激素的代表，研究顯示［2］它可以通過抑制性調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)，在垂體水平控制促性腺激素的釋放，抑制排卵。NOMAc還可抑制孕酮誘導(dǎo)的上皮細胞分泌，抑制子宮內(nèi)膜增生，有助于EMs的治療，但作用機制還少見報道。為此，我們應(yīng)用實驗性EMs大鼠模型，研究NOMAc對血清中EMAb水平的影響和異位內(nèi)膜中凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ♀成熟未孕清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠65只，實驗前體質(zhì)量為200～250 g，由上海西普爾-必凱公司提供，合格證號:SCXK(滬)2008-0016。

1.1.2 藥品和試劑 諾美孕酮醋酸酯:純度99.49%，由浙江仙琚制藥股份有限公司提供，批號:100405-8;孕三烯酮膠囊:由北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:53100201340。ELISA試劑盒(EMAb)購自美國ADL生物科技公司;蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Bax、Bcl-2、β-actin購自美國 S anta Cruz公司;Caspase-9、Caspase-3、HRP 標記的羊抗兔 I gG，購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照文獻［3］選取動情周期規(guī)則的SD大鼠65只。手術(shù)在無菌環(huán)境中進行，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠1 ml·kg-1。將大鼠仰臥四肢固定于手術(shù)臺上，腹部消毒后做2～3 cm切口，游離右側(cè)子宮，剪取靠近卵巢處約1.5 cm一段子宮置入含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，肌層與子宮內(nèi)膜層分離后，將內(nèi)膜剪成5 mm×5 mm大小與腹壁肌肉縫合固定，常規(guī)關(guān)腹。

1.2.2 模型的判定 模型建立3周后，第2次剖腹，用游標卡尺測量移植物的長mm、寬mm、高mm，并記錄觀察移植物的生長情況，存活與否。EMs模型建模成功觀察標準［4］:移植灶體積增大(體積大于25 mm3;高度大于1 mm)，呈透明的結(jié)節(jié)狀、囊狀、有澄清液體積聚，移植物被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，質(zhì)地軟。

1.2.3 分組給藥及解剖取材 造模成功的大鼠隨機分為模型對照組(0.5%CMC-Na 1.5 ml·kg-1·d-1)、孕三烯酮陽性對照(1.5 mg·kg-1·d-1)以及諾美孕酮(0.5、1.5、15 mg·kg-1·d-1)，分別相當(dāng)于人(60 kg)用劑量 5、15、150 mg·d-1，每組 13只。孕三烯酮和諾美孕酮溶解于0.5%CMC-Na中配成混懸液。連續(xù)灌胃21 d，在末次給藥24 h內(nèi)麻醉解剖大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，測量異位內(nèi)膜大小，立即取出異位內(nèi)膜組織，于液氮保存。

1.2.4 HE染色和異位子宮內(nèi)膜厚度測量 將置于4%多聚甲醛中固定的正常子宮和異位內(nèi)膜進行常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察正常子宮及異位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)特點。每張切片隨機選取10個不同位置，用圖像分析軟件測量內(nèi)膜厚度，最后取均值。

1.2.5 ELISA檢測血清中EMAb水平 測定方法按照說明書操作步驟進行，所有樣本均設(shè)置復(fù)孔檢驗以減少誤差。最后在450 nm波長處讀取吸光度值，做出標準曲線讀出EMAb的濃度。

1.2.6 Western blot分析 異位內(nèi)膜組織加蛋白裂解液冰上勻漿，離心后取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每份樣本取80 μg進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜110 V，1.5 h，一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-9(1∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)和β-actin(1∶1 000)室溫孵育1 h，ECL顯色液顯影，掃描灰度值。各目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

Fig 1 Effect of NOMAc on eutopic endometrium and ectopic endometrium of rats(100×)

2 結(jié)果

2.1 諾美孕酮對在位子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 鏡下觀察到在位子宮內(nèi)膜上皮細胞為柱狀;間質(zhì)細胞小而密，腺體數(shù)量多，腺腔小，可見核下空泡和頂漿分泌(Fig 1A)。模型對照組異位內(nèi)膜生長良好，胞質(zhì)豐富，腺體數(shù)量多，腺腔大，腔內(nèi)有滲出物(Fig 1B)。NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)異位內(nèi)膜萎縮，囊內(nèi)積液體積減少，間質(zhì)疏松，腺體數(shù)目明顯減少，腺腔明顯萎縮，NOMAc(15 mg·kg-1)部分動物異位內(nèi)膜消失(Fig 1D～F)。

2.2 諾美孕酮對異位子宮內(nèi)膜厚度的影響 與模型對照組相比，NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)在位子宮內(nèi)膜厚度差異無顯著性(P＞0.05)。NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)異位內(nèi)膜厚度呈劑量依賴性地降低，且與模型對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)(Tab 1)。提示NOMAc對在位子宮內(nèi)膜厚度無影響，而可以降低異位子宮內(nèi)膜厚度。

Tab 1 Effect of NOMAc on the thickness of eutopic and ectopic endometrium in rats(±s，n=5)

Tab 1 Effect of NOMAc on the thickness of eutopic and ectopic endometrium in rats(±s，n=5)

*P＜0.05 vs model group;#P＜0.05 vs gestrinone group

Group Dose/mg·kg-1 Endometrium thickness Eutopic/μm Ectopic/μm Model - 506.98±122.43 1515.50±492.89 Gestrinone 1.5 547.28±78.66 1063.07±267.23*NOMAc low 0.5 554.6±101.08 669.27±164.51*NOMAc medium 1.5 602.88±120.49 641.79±553.15*NOMAc high 15 534.36±100.69 553.25±268.01*#

2.3 諾美孕酮對血清中EMAb水平的影響 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)血清中 EMAb 水平呈劑量依賴性地降低。與模型對照組相比，NOMAc(15 mg·kg-1)血清中EMAb水平明顯降低(P＜0.05)，見 Tab 2。

Tab 2 Effect of NOMAc on the concentration of EMAb of blood serum in rats(±s，n=5)

Tab 2 Effect of NOMAc on the concentration of EMAb of blood serum in rats(±s，n=5)

*P＜0.05 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 EMAb/μg·L -1 Model - 4.00±0.65 Gestrinone 1.5 3.94±0.84 NOMAc low 0.5 3.64±0.59 NOMAc medium 1.5 3.40±0.64 NOMAc high 15 3.37±0.44*

2.4 諾美孕酮對Bcl-2、Bax表達的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，Bax隨NOMAc劑量增大表達增加，而Bcl-2隨NOMAc劑量增大表達減少。與模型對照組相比，NOMAc(1.5、15 mg·kg-1)Bax和 Bcl-2 蛋白的表達差異有顯著性(P＜0.05)，見Fig 2。

2.5 諾美孕酮對Caspase-3 and Caspase-9表達的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，在模型對照組中Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達較少，在孕三烯酮對照和NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)表達增加，且與NOMAc劑量效應(yīng)呈正相關(guān)。與模型對照組相比，NOMAc(15 mg·kg-1)Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9表達明顯升高(P＜0.05)，見 Fig 3。

3 討論

EMs所導(dǎo)致的痛經(jīng)和慢性盆腔疼痛、性交痛、月經(jīng)異常以及不孕已嚴重困擾著患者的健康和生活質(zhì)量［5］。細胞凋亡異常可能是EMs發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。在臨床中，可以通過藥物或其它細胞因子誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細胞凋亡，同時又不損傷正常組織細胞，從而達到治療EMs的目的。如常用治療藥物GnRH-a能夠提高EMs在位和異位內(nèi)膜細胞的凋亡;長期口服避孕藥通過降低Bcl/Bax的比例提高EMs在位內(nèi)膜細胞的凋亡;丹那唑組織異位組織DNA 合成，誘導(dǎo)細胞凋亡［6］。

Fig 2 Effect of NOMAc on the expression of Bcl-2，Bax of ectopic endometrium in rats(n=5)

NOMAc是一種19-去甲孕酮衍生物，與天然的黃體酮極其相似，被看作是“純”孕激素。NOMAc有很強的孕激素活性，與天然E2合用時，可獲得良好的避孕效果和月經(jīng)周期調(diào)控，2011年8月已獲準在歐洲上市。NOMAc對糖代謝、脂代謝、血液學(xué)、肝臟微粒體酶無明顯影響。體外研究顯示，NOMAc可抑制正常乳腺組織和乳腺癌細胞中雌酮向E2的轉(zhuǎn)換，不刺激乳腺癌細胞增生，因而不會增加乳腺癌的發(fā)病率［7-8］。還可以用于治療 EMs［9］。然而作用機制還少見報道。孕激素主要通過抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能、改變血液流變性、調(diào)節(jié)免疫功能、促進異位組織凋亡、抑制血管形成等方面治療EMs［10］。

Fig 3 Effect of NOMAc on the expression of Caspase-9，Caspase-3and cleaved Caspase-3 of ectopic endometrium in rats(n=5)

本文結(jié)果顯示NOMAc可以使異位內(nèi)膜明顯萎縮，降低異位內(nèi)膜厚度，對正常子宮內(nèi)膜厚度無明顯影響。表明NOMAc可以抑制異位內(nèi)膜增生，同時不影響正常子宮內(nèi)膜生長。

EMAb是EMs的標志抗體。在卵巢激素作用下，異位內(nèi)膜種植灶產(chǎn)生的內(nèi)膜碎屑沉入盆腔，被巨噬細胞吞噬后，內(nèi)膜中一些抗原成分識別，激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生EMAb。眾多研究表明EMs患者EMAb陽性率明顯升高，且隨病情加重或好轉(zhuǎn)，EMAb水平也隨之升高或降低［11］。本實驗研究結(jié)果表明 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)可以降低大鼠血清中的EMAb，提示NOMAc對EMs的作用機制可能與降低EMAb水平有關(guān)。

細胞凋亡涉及一系列的蛋白，Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促凋亡基因。Taniguchi等［12］報道，Bcl-2在正常子宮內(nèi)膜中隨月經(jīng)周期而發(fā)生變化，增生期最強，分泌早、中期減少，分泌晚期及月經(jīng)期消失，其消失恰與月經(jīng)周期中的凋亡增加一致。異位的子宮內(nèi)膜在離開宮腔后仍然可以繼續(xù)增長是和細胞凋亡受到抑制有關(guān)。由于細胞凋亡受到抑制，異位內(nèi)膜可通過Bcl-2蛋白高表達、Bax蛋白低表達來增強自身的抗凋亡的能力，得以在子宮腔被覆粘膜以外種植和生長［13］。本實驗結(jié)果表明 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)對Bcl-2和Bax的表達分別有下調(diào)和上調(diào)作用，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。高劑量組差異呈顯著性(P＜0.05)。提示NOMAc可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax水平，發(fā)揮抑制異位內(nèi)膜生長的作用。

Caspase家族蛋白在不同凋亡激活途徑中都起到關(guān)鍵的作用。Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑的啟動因子，Caspase-3是位于級聯(lián)反應(yīng)下游的最重要的凋亡效應(yīng)分子，能被上游的啟動因子激活［14］。本實驗進一步研究表明NOMAc可明顯升高Caspase-9和Caspase-3蛋白表達水平(P＜0.05)。提示NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)通過上調(diào)異位內(nèi)膜細胞內(nèi)源性凋亡啟動因子Caspase-9，從而激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3來達到促進異位內(nèi)膜細胞凋亡的目的。

綜上所述，我們認為 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)可促進大鼠子宮異位內(nèi)膜細胞凋亡，其作用機制可能與降低EMAb水平、上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白表達、激活細胞凋亡的內(nèi)源性途徑啟動因子Caspase-9蛋白、激活執(zhí)行因子Caspase-3蛋白表達有關(guān)。NOMAc是否還通過其他作用機制發(fā)揮治療EMs的作用，還需進一步實驗證明。

［1］Baldi A，Campioni M，Signorile P G.Endometriosis:pathogenesis，diagnosis，therapy and association with cancer［J］.Oncol Rep，2008，19(4):843-6.

［2］朱 焰，謝淑武，曹 霖.新型孕激素及抗孕激素國外研發(fā)進展［J］.中國新藥雜志，2011，20(19):1880-5.

［2］Zhu Y，Xie S W，Cao L.Advance in new generation of progestin and anti-progestin［J］.Chin J New Drugs，2011，20(19):1880-5.

［3］王小翠，楊 洋，陳 剛，等.加味佛手散抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成及其機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(3):350-4.

［3］Wang X C，Yang Y，Chen G，et al.Inhibitory effects of Jiawei Foshousan on angiogensis of endometrisis in rats model and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(3):350-4.

［4］楊耀芳，王 茂，方學(xué)明.建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的評價方法［J］.中國藥理學(xué)通報，1998，14(5):469-70.

［4］Yang Y F，Wang M，F(xiàn)ang X M.Establishement of rats endometriosis model evaluation method［J］.Chin Pharmacol Bull，1998，14(5):469-70.

［5］Missmer S A.Endometriosis epidemiologic considerations for a potentially high-risk population［J］.Int J Epidemiol，2009，38(4):1154-5.

［6］居文惠.細胞凋亡與子宮內(nèi)膜異位癥［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15(6):129-30.

［6］Ju W H.Apoptosis and endometriosis［J］.Chin J Birth Health Hered，2007，15(6):129-30.

［7］朱 焰，孫祖越，曹 霖.醋酸諾美孕酮藥理作用研究進展

［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(11):1215-7.

［7］Zhu Y，Sun Z Y，Cao L.New light on nomegestrol acetate pharmacological profile［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(11):1215-7.

［8］朱 焰，孫祖越，曹 霖.第四代孕激素研究進展［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41(8):572-6.

［8］Zhu Y，Sun Z Y，Cao L.Advance in fourth progestin［J］.Chin Pharm J，2006，41(8):572-6.

［9］Charpin C，Illouz S，Dales J P，et al.Effects of progestins on human endometriumin vitro［J］.Bull Acad Med，2002，186(1):125-45.

［10］M?nckedieck V，Sannecke C，Husen B，et al.Progestins inhibit expression of MMPs and of angiogenic factors in human ectopic endometrial lesions in a mouse model［J］.Mol Hum Reprod，2009，5(10):633-43.

［11］朱小鳳，蔣鳳艷.血清CA125、EmAb在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用［J］.中外醫(yī)療，2010，29(18):1-3.

［11］Zhu X F，Jiang F Y.The role of CA125 and EmAb in the serum of patients with endometriosis［J］.China Foreign Med Treatment，2010，29(18):1-3.

［12］Taniguchi F，Kaponis A，Izawa M，et al.Apoptosis and endometriosis［J］.Front Biosci，2007，1(3):3140-51.

［13］Za?rat’iants O V，Adamian L V，Andreeva E N，et al.Molecular biological features of ectopic and eutopic endometrium in genital endometriosis［J］.Arkh Patol，2010，72(5):6-12.

［14］Mazumder S，Plesca D，Almasan A.Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis［J］.Methods Mol Biol，2008，414:13-21.