豹皮樟總黃酮對(duì)非酒精性脂肪性肝炎治療作用及部分機(jī)制

王建青，李 俊，鄒宇宏，魯 超，程文明，呂雄文，金 涌，張 磊，黃 成

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院、安徽天然藥物活性研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥三級(jí)實(shí)驗(yàn)室“中藥藥理實(shí)驗(yàn)室”;2.第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230032;3.印第安娜大學(xué)-普渡大學(xué)-印第安納波利斯，美國(guó)印第安娜 46202;4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230032)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是指繼發(fā)于非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)合并肝脂肪變性與炎癥的一種疾病，是目前慢性肝臟疾病的最常見(jiàn)原因，與肥胖、胰島素抵抗及高脂血癥等密切相關(guān)，能進(jìn)一步發(fā)展成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重影響人類健康［1］。但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，治療方法有限［2-3］。目前認(rèn)為NASH是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，其中Day等［4］提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)被廣泛認(rèn)可，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積對(duì)肝臟造成“第一次打擊”;隨后經(jīng)氧化應(yīng)激誘發(fā)炎癥和細(xì)胞凋亡對(duì)肝臟形成“第二次打擊”，發(fā)展成NASH。豹皮樟，又名老鷹茶，系樟科木姜子屬毛豺皮樟(Litsea Coreana leve)的葉，含有多種活性成分，經(jīng)我院天然藥物化學(xué)教研室研究，確定了豹皮樟的有效部位為總黃酮(total flavonoids)，其總黃酮含量不低于70%。我們前期研究表明豹皮樟總黃酮(total flavonoids ofLitsea Coreana leve，TFLC)具有明顯的抗炎免疫作用［5］，為進(jìn)一步研究 TFLC對(duì) NASH的治療作用機(jī)制，本研究采用高脂乳劑灌胃復(fù)制大鼠NASH模型，觀察TFLC對(duì)NASH的治療作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Spague-Dawlay(SD)大鼠50只，清潔級(jí)，♂，體質(zhì)量200～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥物和試劑 TFLC由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提取，經(jīng)我院天然藥物化學(xué)教研室鑒定，總黃酮含量＞70%。臨用前用0.5%CMC-Na配成相應(yīng)濃度。1-2丙二醇、吐溫80(AR級(jí))、膽固醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，脫氧膽酸鈉購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，ALT、AST測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TC、TG測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京福瑞生物工程公司，TLR4、NF-κB p65(H-286)、Lamin A/C和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，DNA Marker DL2000購(gòu)于TaKaRa Biotechnology，TLR4、β-actin引物由上海生工生物公司合成，TNF-α放射免疫分析測(cè)定盒(批號(hào)20050420)購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 動(dòng)物模型的建立與給藥方法［6］大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組和不同劑量(100、200、400 mg·kg-1)TFLC 治療組，每組10 只。除正常組外，其余各組均每天灌胃給予高脂乳劑(10 mg·kg-1)，連續(xù)10周;正常組皮下注射等量的花生油溶液。治療組于造模第6周起(脂肪肝初步形成時(shí))給予相應(yīng)的藥物灌胃給藥，每天1次，直至造模結(jié)束，共5周;正常組和模型組予以等量的0.5%CMC-Na。所有動(dòng)物都給予自來(lái)水和大鼠飼料喂養(yǎng)。于第10周末，所有大鼠禁食12 h，稱重，麻醉，腹主動(dòng)脈采血，常規(guī)制備血清;留取肝臟組織標(biāo)本，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 血清和肝臟生化指標(biāo) 血清 ALT、AST、TC、TG、TNF-α和肝勻漿TC、TG含量的檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒要求規(guī)范操作。

1.5 病理形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織以10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察肝脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況。肝細(xì)胞脂肪變性程度和炎癥活動(dòng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。

1.6RT-PCR法檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá) 稱取大鼠肝組織100 mg，TRIzol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄取總RNA 2 μg，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;PCR以cDNA為模板，擴(kuò)增TLR4片段。引物根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)合成，TLR4的上游引物為5'-AGT GGG TCA AGG AAC AGA AGC A-3'，下游引物為5'-CTT TAC CAG CTC ATT TCT CAC C-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為504 bp。β-actin的上游引物為5'-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG-3'，下游引物為 5'-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 285 bp。

1.7 Western blot法檢測(cè) TLR4 和 NF-κB 蛋白表達(dá) 抽提肝臟組織總蛋白檢測(cè)TLR4蛋白水平，參照Deryckere and Gannon法提取核蛋白檢測(cè)NF-κB p65蛋白水平，準(zhǔn)確定量后，取30 μg的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉3 h，加TLR4或NF-κB p65一抗，4℃過(guò)夜，洗膜后，孵育二抗，室溫1 h，暗室顯影，壓片掃描后進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1TFLC對(duì)NASH大鼠ALT、AST的影響 結(jié)果如Tab 1所示，與正常組比較，模型組大鼠血清ALT和AST水平明顯升高;不同劑量(100、200和400 mg·kg-1)TFLC干預(yù)均能降低NASH大鼠血清ALT和AST水平，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 TFLC對(duì)NASH大鼠血清與肝臟脂質(zhì)的影響

結(jié)果如Tab 2所示，與正常組比較，模型組大鼠血清與肝臟TG與TC含量均明顯升高;與模型組相比，不同劑量(100、200和400 mg·kg-1)TFLC干預(yù)明顯降低大鼠血清和肝臟TG和TC含量，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

Tab 1 Effects of TFLC on serum ALT and AST content in NASH rats(±s，n=10)

Tab 1 Effects of TFLC on serum ALT and AST content in NASH rats(±s，n=10)

##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 ALT/U·L-1 AST/U·L -1 Control - 32.59±3.46 44.38±5.57 Model - 66.70±7.65## 85.18±9.24##TFLC 100 44.40±5.62＊＊ 72.72±7.92＊＊TFLC 200 39.70±5.08＊＊ 56.65±6.29＊＊TFLC 400 37.30±3.83＊＊ 46.53±6.52＊＊

2.3 TFLC對(duì)NASH大鼠血清TNF-α的影響 為觀察TFLC對(duì)NASH大鼠血清TNF-α水平的影響，用放射免疫法檢測(cè)血清TNF-α水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α含量明顯升高;與模型組比較，不同劑量(100、200和400 mg·kg-1)TFLC干預(yù)明顯降低血清TNF-α水平，呈劑量效應(yīng)關(guān)系(Tab 3)。

Tab 2Effects of TFLC on serum and liver TG，TC contents in NASH rats(±s，n=10)

Tab 2Effects of TFLC on serum and liver TG，TC contents in NASH rats(±s，n=10)

##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 TG/mmol·L-1 Serum Liver TC/mmol·L-1 Serum Liver Control - 1.59±0.11 1.50±0.14 1.96±0.20 0.24±0.04 Model - 2.74±0.34## 2.28±0.16## 3.96±0.46## 1.10±0.18##TFLC 100 2.13±0.07＊＊ 1.88±0.14＊＊ 2.86±0.17＊＊ 0.63±0.05＊＊TFLC 200 2.06±0.04＊＊ 1.71±0.09＊＊ 2.66±0.11＊＊ 0.57±0.05＊＊TFLC 400 1.57±0.10＊＊ 1.56±0.12＊＊ 2.39±0.14＊＊ 0.49±0.08＊＊

2.4 TFLC對(duì)NASH大鼠肝臟病理學(xué)的影響 為觀察TFLC對(duì)NASH大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響，用HE染色法檢查大鼠肝臟病理學(xué)改變，正常組大鼠肝臟無(wú)異常變化(Fig 1A);模型組大鼠肝臟呈現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，且存在小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎癥，以及點(diǎn)狀壞死或壞死灶，肝組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)肝纖維化改變(Fig 1B);不同劑量(100、200和400 mg·kg-1)TFLC干預(yù)有不同程度的改善作用，以400 mg·kg-1TFLC作用最為明顯，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(Fig 1C～E)。

Fig 1 Photomicrographs of liver sections stained with HE stains

2.5 TFLC對(duì)大鼠肝組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)的影響 為觀察TFLC對(duì)NASH大鼠肝臟TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)的影響，分別用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TLR4 mRNA與蛋白水平，結(jié)果如Fig 2所示，與正常組大鼠比較，NASH大鼠肝臟TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯升高;而TFLC(200 mg·kg-1)可明顯抑制 NASH大鼠肝組織TLR4 mRNA與蛋白表達(dá)水平。

Fig 2 The level of TLR4 mRNA and protein in liver

2.6 TFLC對(duì)大鼠肝組織NF-κB核蛋白水平的影響 為觀察TFLC對(duì)NASH大鼠肝臟NF-κB核蛋白水平的影響，提取肝臟核蛋白后，用Western blot技術(shù)檢測(cè)NF-κB核蛋白水平，結(jié)果如Fig 3所示，與正常組大鼠比較，NASH大鼠肝臟NF-κB核蛋白水平明顯升高;而200 mg·kg-1TFLC明顯降低NASH大鼠肝臟NF-κB核蛋白水平。

Tab 3 Effects of TFLC on serum TNF-αcontent in NASH rats(±s，n=10)

Tab 3 Effects of TFLC on serum TNF-αcontent in NASH rats(±s，n=10)

##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 TNF-α/mol·L -1 Control - 0.92±0.15 Model - 2.39±0.07##TFLC 100 2.07±0.08＊＊TFLC 200 1.73±0.03＊＊TFLC 400 1.42±0.04＊＊

3 討論

NAFLD及其進(jìn)一步發(fā)展形成的NASH是目前最常見(jiàn)的肝臟疾病。盡管目前認(rèn)為單純性脂肪肝屬于良性狀態(tài)，但NASH可進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌［8］。研究顯示大多數(shù)隱源性肝硬化被證實(shí)來(lái)源于NASH，因此對(duì)NASH的治療以及阻斷其進(jìn)一步發(fā)展顯得尤為重要［3］。

本研究采用脂肪乳劑灌胃法成功建立了NASH模型，在造模10周后，發(fā)現(xiàn)模型組血清ALT和AST水平明顯升高，血清和肝臟TC和TG含量均明顯升高，病理顯示肝臟組織出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，伴有炎癥和壞死等特征，與NASH的病理生理學(xué)改變相符［1，9］。與模型組比較，TFLC干預(yù)能降低血清ALT、AST、TG、TC 和肝臟中的TG、TC 含量，HE 染色也顯示肝臟脂肪變性和炎癥程度減輕，表明TFLC對(duì)NASH具有一定治療作用。

Fig 3 The protein expression of nuclear NF-κB p65 subunit in liver

NASH的發(fā)病目前尚不能以單一的機(jī)制解釋，“二次打擊”學(xué)說(shuō)將各種因素引起的肝細(xì)胞脂肪積聚和脂肪變性作為“初次打擊”，使肝臟對(duì)炎癥反應(yīng)和各種損傷因素的易感性增高［10］。近年來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn)NASH患者常伴有小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，腸源性內(nèi)毒素血癥、腸黏膜屏障功能減退等特征，提示腸道環(huán)境的改變可能在NASH的發(fā)病過(guò)程中起重要作用［11-12］。Toll樣受體 4(Toll like receptor 4，TLR4)作為內(nèi)毒素受體，在肝損傷中起重要作用;其下游的核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是細(xì)胞中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用［13］。研究表明炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，尤其是細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)引起的TLR4信號(hào)途徑的激活是酒精性肝病發(fā)生的重要機(jī)制［14］。因此，調(diào)控TLR4信號(hào)通路成為治療NASH的新研究靶點(diǎn)。LPS與肝臟TLR4受體結(jié)合激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，繼而調(diào)控各種效應(yīng)基因的表達(dá)，產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6)等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)并引起肝臟壞死［15］。研究報(bào)道TLR4基因突變的大鼠(C3H/HeJ)對(duì)LPS的反應(yīng)降低，并且能阻斷下游的一系列效應(yīng)，如TNF-α表達(dá)的明顯降低，肝臟的脂肪變性、炎癥以及肝硬化程度減輕［14］。Gyongyi等［16］研究表明非酒精性脂肪性肝炎大鼠在 TLR4配體作用下，可以增加肝臟的損傷以及炎癥因子的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路在NASH形成過(guò)程中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠肝臟中TLR4 mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯升高，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核蛋白水平明顯升高，血清中炎癥細(xì)胞因子 TNF-α含量也明顯增加，表明TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路被激活。在給予TFLC干預(yù)后，能明顯抑制模型組大鼠TLR4 mRNA水平和蛋白表達(dá)，明顯降低NF-κB核蛋白水平，并明顯減少血清中炎癥因子TNF-α含量。這些研究結(jié)果提示TFLC對(duì)NASH的治療作用可能與TLR4介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

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